JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 4:11 min. • July 8th, 2025
Najbardziej wewnętrzna warstwa rogówki świni - przezroczysta, jałowa część przedniego oka - składa się z komórek śródbłonka rogówki lub CEC, wspieranych przez błonę podstawną - błonę Descemeta lub DM. CEC utrzymują przezroczystość rogówki i optymalne widzenie. Wszelkie ich uszkodzenia mogą mieć wpływ na widzenie.
W przypadku selektywnego uszkodzenia CEC należy rozpocząć od świeżo zebranego oka świni w odpowiednim podłożu. Usuń otaczające tkanki. Oczyść oko odpowiednim środkiem dezynfekującym, aby wyeliminować zanieczyszczenie mikrobiologiczne powierzchni. Po przemyciu solą fizjologiczną należy zbadać optycznie przednie oko, aby wykluczyć wszelkie nieprawidłowości przed naświetlaniem laserowym.
Zabezpiecz oko w dostosowanym do tego celu aparacie przytrzymującym przed lampą szczelinową wyposażoną w laser o określonej długości fali. Wizualizacja poszczególnych warstw rogówki. Przy odpowiedniej energii lasera i położeniu punktu ostrości skieruj impulsy laserowe do warstwy śródbłonka rogówki. Skupione, krótkotrwałe impulsy o dużej mocy powodują selektywne pękanie CEC z odsłoniętej powierzchni, unikając jednocześnie dyfuzji ciepła, chroniąc w ten sposób DM lub tkankę zrębu.
Tworząc port wejściowy w pobliżu rąbka - połączenia korowo-twardówkowego, wstrzyknij lepkosprężysty roztwór do przedniej komory zawierającej rogówkę, aby ją ustabilizować i chronić pozostałe CEC. Wyciąć i przenieść segment rogówki poddany obróbce laserowej na płytkę wielodołkową zawierającą podłoże, stroną CEC skierowaną do góry. Model uszkodzenia śródbłonka rogówki ex vivo może być wykorzystany do dalszych badań.
Po uzyskaniu świeżo wyłuszczonych oczu świń z lokalnej rzeźni, próbki należy umieścić w pełnym podłożu o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyj nożyczek, aby usunąć tkanki zewnątrzkomórkowe i zanurz oczy w 5% roztworze okulistycznym z jodonem powidonu na pięć minut. Następnie zdezynfekowane próbki należy umieścić w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej.
Za pomocą urządzenia do optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej przebadaj oczy pod kątem głównych patologii przedniego odcinka, takich jak bliznowacenie rogówki, obrzęk i inne zmętnienia. Po badaniu przesiewowym należy ustawić oczy przed lampą szczelinową wyposażoną w laser Nd:YAG o długości fali 1064 nanometrów i średnicy ogniska 10 mikrometrów w powietrzu. Wybierz 12-krotne powiększenie i odchyl oświetlenie, aby uwidocznić poszczególne warstwy rogówki.
Po ustawieniu energii impulsu i skupieniu punktu na odpowiednie parametry do selektywnej ablacji komórek śródbłonka rogówki, należy przyłożyć do tkanki kilka strzałów laserowych. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, umieść przezroczystą paracentezę rogówki w pobliżu rąbka i wstrzyknij lepkosprężystość, aby ustabilizować komorę wewnętrzną. Następnie użyj 8-milimetrowej trepanacji, aby wyciąć środkową rogówkę poddaną działaniu lasera i umieść izolowaną rogówkę w jednym dołku 12-dołkowej płytki, śródbłonkiem do góry. Po zebraniu wszystkich rogówek dodaj 3 mililitry pełnej pożywki do każdej studzienki próbki i inkubuj próbki przez okres do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza.