JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 3:15 min. • July 8th, 2025
Witryfikacja zarodków to ultraszybka technika kriokonserwacji, która schładza zarodki w niezwykle szybkim tempie do bardzo niskich temperatur, ułatwiając ich długotrwałe przechowywanie.
Na początek weź zebrane zarodki królika w odpowiedniej pożywce. Inkubować zarodki z roztworem równoważącym zawierającym niskie stężenia przenikających przez komórki krioprotektantów - glikolu etylenowego lub EG i dimetylosulfotlenku lub DMSO. EG i DMSO dyfundują przez błony komórkowe, zastępując cząsteczki wody wewnątrz komórek i zapobiegając tworzeniu się wewnątrzkomórkowych kryształków lodu.
Następnie inkubuj zarodki z roztworem witryfikacyjnym zawierającym wyższe stężenia EG i DMSO, aby umożliwić odpowiednie przenikanie krioprotektantów i wystarczający wewnątrzkomórkowy wypływ wody, chroniąc komórki przed uszkodzeniem przez zamarzanie.
Podłącz sterylny kriogeniczny nośnik słomy do mikrodozownika. Za pomocą mikrodozownika napełnij słomkę żądanym podłożem do odpowiedniego poziomu. Następnie odessać pęcherzyk powietrza, a następnie minimalną objętość roztworu witryfikacyjnego zawierającego zarodki i kolejny pęcherzyk powietrza.
Ponownie zasysać pożywkę, aż pierwsza frakcja podłoża po prostu zwilży i spolimeryzuje malowaną proszkowo bawełnianą zatyczkę, uszczelniając koniec słomy. Zamknij drugi koniec hydrofobową zatyczką słomkową. Segmenty powietrza i pożywki pomagają izolować zarodki w zamkniętym nosicielu.
Zanurz na krótko słomkę w ciekłym azocie w temperaturze -196°C. Nośnik zapewnia wysokie tempo chłodzenia, zestalając zarodki w szklistą fazę amorficzną, a niewielka objętość roztworu witryfikacyjnego i zastosowane krioprotektanty łagodzą stres osmotyczny. Zarodki zeszklone, z zawieszoną aktywnością metaboliczną, mogą być przechowywane do czasu wykorzystania.
W przypadku witryfikacji zarodków zanurzyć zarodki w roztworze równoważącym na 2 minuty, a następnie wykonać 1-minutową inkubację w roztworze do witryfikacji. Pod koniec inkubacji załaduj zarodki do plastikowej płytki o pojemności 125 mikrolitrów i połącz zamknięty koniec słomki z odpowiednim mikrodozownikiem o pojemności 1 mililitra. Zassać podłoże bazowe do jednej trzeciej długości słomki, a następnie wprowadzić mały pęcherzyk powietrza.
Następnie użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zaaspirować zarodki w 40 mikrolitrach roztworu witryfikacyjnego, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza w wystarczającej ilości podłoża podstawowego, aby przesunąć pierwszą frakcję płynną do bawełnianego końca ministraw. Następnie zamknij otwarty koniec ministraw słomkowym korkiem, zanurz ministraw bezpośrednio w ciekłym azocie, aby uzyskać witryfikację, i przechowuj ministraw w dewarze z ciekłym azotem.