Name: Badanie zależnej od wieku niestabilności genomu przy użyciu chronologicznego modelu długości życia S. cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę badania niestabilności genomowej zależnej od wieku w drożdżach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu testów mutacji DNA i analizy przeżywalności. Technika ta pozwala identyfikować geny i szlaki związane z niestabilnością DNA podczas starzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy S. Jinks Robertson i E. Heidenreich za udostępnienie plazmidów i szczepów drożdży; P. Pham i M.F. Goodman za pomoc przy teście TLS. Praca ta była częściowo wspierana przez grant American Federation for Aging Research oraz granty NIH AG20642, AG025135.

<ol><li>Longo, V. D., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+medicine%3A+from+dwarf+model+systems+to+healthy+centenarians%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians.</a> Science. 299, 1342-1346 (2003).</li>
<li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328, 321-326 (2010).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183, 1751-1752 (1959).</li>
<li>Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calendar+life+span+versus+budding+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).</li>
<li>Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+control+and+cellular+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Replication control and cellular life span.</a> Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).</li>
<li>Pohley, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formal+mortality+analysis+for+populations+of+unicellular+organisms+%28Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).</li>
<li>Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+activity+is+essential+for+stationary+phase+survival+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Mitochondrial+production+of+toxic+oxygen+species+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo.</a> J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).</li>
<li>Longo, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.+Studies+of+superoxide+dismutase%2C+Ras+and+Bcl-2+%5B%5D%22">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]</a>. , University of California Los Angeles. California Los Angeles. (1997).</li>
<li>Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+longevity+and+stress+resistance+by+Sch9+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast.</a> Science. 292, 288-290 (2001).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2, 73-81 (2003).</li>
<li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+extension+by+calorie+restriction+depends+on+Rim15+and+transcription+factors+downstream+of+Ras%2FPKA%2C+Tor%2C+and+Sch9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9.</a> PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Fabrizio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tor1%2FSch9-regulated+carbon+source+substitution+is+as+effective+as+calorie+restriction+in+life+span+extension%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension.</a> PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).</li>
<li>Capizzi, R. L., Jameson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+table+for+the+estimation+of+the+spontaneous+mutation+rate+of+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture.</a> Mutat Res. 17, 147-148 (1973).</li>
<li>Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+end+joining+as+an+important+mutagenic+process+in+cell+cycle-arrested+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells.</a> Embo J. 22, 2274-2283 (2003).</li>
<li>Heidenreich, E., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+and+selection-induced+mutations+in+respiration-competent+and+respiration-deficient+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).</li>
<li>Chen, C., Kolodner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li>
<li>Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2%2FMsn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li>
<li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner%2FBloom+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Kultury starzejące się w cieczy czasami wykazują fenotyp odrastania/gasping13, co komplikuje analizę CLS. Odrastanie zazwyczaj występuje, gdy więcej niż 90-99% populacji straci żywotność. Fenotyp ten jest często powiązany ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i/lub zmniejszoną ochroną komórki. Na przykład częstotliwość występowania tego fenotypu ponad dwukrotnie wzrasta w komórkach pozbawionych cytozolowej dysmutazy ponadtlenkowej i znacznie zmniejsza się u mutantów długowiecznych (np. sch9Δ lub ras2Δ) lub mutantów nadekspresujących dysmutazy ponadtlenkowe22. W praktyce definiujemy odrastanie jako wzrost żywotności lub stabilizację żywotności podczas 3 kolejnych prób pobrania próbek w fazie wysokiej śmiertelności podczas starzenia chronologicznego.
Częstość występowania różnych mutacji DNA w zależności od wieku znacznie różni się w zależności od tła szczepu, manipulacji genetycznych, warunków hodowli, a także odjawisk odrastania/gaspingu oraz ekstremalnie niskiej przeżywalności. Przed przeprowadzeniem pełnoobszałowej analizy długości życia należy wykonać eksperymenty wstępne w punktach czasowych odpowiadających średniej i maksymalnej przeżywalności, przy różnych gęstościach wysiewu w testach mutacji, aby określić zakres częstości mutacji. Szczep typu dzikiego powinien być zawsze włączany do badania długości życia lub częstości mutacji równolegle do każdej manipulacji lub mutanta genetycznego, tak aby można było uwzględnić różnice między eksperymentami. W badaniu należy uwzględnić wielokrotne repliki biologiczne, a w celu potwierdzenia wyników należy przeprowadzić testy żywotności/mutacji zarówno w formie ciekłej, jak i in situ.
Zamiast skupiać się na jednym konkretnym typie mutacji DNA, profilowanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem kombinacji wielu testów może rzucić światło na specyficzne uszkodzenia DNA oraz systemy naprawy uszkodzeń DNA, które przyczyniają się do tej niestabilności. Na przykład u dzikich szczepów drożdży obserwuje się znaczący wzrost liczby dużych reorganizacji chromosomowych (GCRs) w porównaniu z innymi mutacjami DNA, co sugeruje zwiększenie liczby pęknięć dwuniciowych i/lub upośledzenie procesu nieswoistego łączenia końców (NHEJ) podczas chronologicznego starzenia się drożdży (Tabela 2). Spektrum mutacji can1 (sekwencjonowanie genu CAN1) uzyskane u starzejących się dzikich szczepów drożdży sugerowało wzrost uszkodzeń oksydacyjnych podczas starzenia chronologicznego oraz podatną na błędy naprawę DNA; natomiast u długowiecznych mutantów sch9Δ zaobserwowano mniejszą liczbę oksydacyjnych uszkodzeń DNA oraz znacznie zredukowaną, podatną na błędy syntezę translesyjną20.
Opisane tutaj metody można dalej rozszerzyć w celu badania zależnej od wieku niestabilności genomicznej. Na przykład komórki spoczynkowe i niespoczynkowe można wyizolować z kultur drożdży w fazie stacjonarnej, stosując metodę gradientu gęstości opisaną przez Allena et al.23. W połączeniu z opisanymi tutaj testami mutacji wykazaliśmy, że znaczna część mutacji zależnych od wieku pochodzi z komórek spoczynkowych, a nie z komórek dzielących się, uszkodzonych lub apoptotycznych20,24.

badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia s. cerevisiae

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Badania z wykorzystaniem modelu starzenia Saccharomyces cerevisiae ujawniły szlaki regulacyjne długości życia, które są częściowo konserwatywne u wyższych eukariotów1-2. Prostota i potencjał modelu starzenia drożdży mogą być również wykorzystane do badania uszkodzeń DNA i utrzymania genomu, a także ich wpływu na rozwój chorób podczas starzenia. W niniejszej pracy opisujemy system służący do badania zależnych od wieku mutacji DNA, w tym substytucji zasad, mutacji z przesunięciem ramki odczytu, masywnych reorganizacji chromosomalnych oraz rekombinacji homologicznej i homeologicznej, a także aktywności naprawy jądrowego DNA, poprzez połączenie chronologicznej długości życia drożdży z prostymi testami uszkodzeń i mutacji DNA. Opisane tutaj metody powinny ułatwić identyfikację genów i szlaków regulujących niestabilność genomiczną oraz mechanizmów leżących u podstaw zależnych od wieku mutacji DNA i nowotworów u ssaków.

W niniejszym opracowaniu opisujemy zestaw testów mutacji DNA, które można połączyć z modelem chronologicznej długości życia drożdży w celu zbadania genów i szlaków regulujących lub przyczyniających się do niestabilności genomowego DNA podczas starzenia.

Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae

Badania z wykorzystaniem modelu starzenia się Saccharomyces cerevisiae pozwoliły odkryć szlaki regulacyjne długości życia, które są częściowo konserwatywne u wyższych eukariotów1-2. ...

Ogólnym celem tej procedury jest badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej u drożdży poprzez połączenie analizy czasu życia chronologicznego z zestawem prostych testów uszkodzeń DNA i mutacji. Cel ten osiąga się najpierw poprzez pobieranie próbek z kultur starzejących się chronologicznie co dwa dni i sprawdzanie żywotności za pomocą oznaczania jednostek tworzących kolonie (CFU). Kolejnym krokiem procedury jest badanie mutacji DNA poprzez pobieranie próbek z kultur starzejących się i wysiewanie komórek na specyficzne dla mutacji podłoże selekcyjne.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w mutacjach DNA podczas chronologicznego starzenia się drożdży poprzez normalizację wyników testu mutacyjnego względem żywotności. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia, takie jak mechanizmy łączące starzenie się i niestabilność genomową w aria. Aby przeprowadzić analizę chronologicznej długości życia drożdży (CLS), należy najpierw zaszczepić pojedynczą kolonię drożdży do 1 mL syntetycznego medium kompletnego z glukozą (SDC) i inkubować przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C. Następnego dnia rozcieńczyć kulturę nocną w 10 mL świeżego medium SDC do wartości OD 600 od 0,05 do 0,1 i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez trzy dni.W trzeciej dobie, gdy komórki znajdują się w fazie stacjonarnej, należy rozcieńczyć każdą próbkę Eloqua 10 000 razy w wodzie autoklawowanej, a następnie pobrać dwie alikwoty po 10 µL z kolby i wysiać po 10 µL każdej rozcieńczonej kultury na płytkę A-Y-E-P-D. Płytkę inkubuje się w temperaturze 30 °C do momentu pojawienia się kolonii. Liczbę powstałych kolonii lub jednostek tworzących kolonie z kultury z trzeciej doby uznaje się za 100% przeżywalności.Kontynuuj pobieranie aliquotów z kultury starzejącej się w kolejnych dniach w celu wysiewania. Dostosuj odpowiednio czynniki rozcieńczenia, aby zapewnić obecność od 20 do 100 kolonii w teście CFU. Pobieranie próbek kończy się, gdy żywotność kultury spadnie poniżej 1% – zazwyczaj między 11. a 13. dniem; żywotność komórek można również badać w komórkach starzejących się na płytkach.Aby rozpocząć ten test, należy zaszczepić pojedynczą kolonię w jednym mililitrze syntetycznego podłoża kompletnego z glukozą i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C przy jednoczesnym wytrząsaniu. Gdy kultura osiągnie gęstość około 10⁸ komórek na mililitr, należy rozcieńczyć ją wodą autoklawowaną do stężeń od 100 do 200 komórek na 10 µL oraz 1000 komórek na 10 µL. Dla każdego szczepu należy przygotować zestaw od 8 do 20 płytek SDC z pominięciem tryptofanu, oznakowanych zgodnie z gęstością wysiewu.Aby zapewnić możliwość przeliczenia od 10 do 100 kolonii, przewidując spadek żywotności w miarę starzenia się, nanieś dwie alikwoty od 10 do 30 µL rozcieńczonej kultury na każdą płytkę. Inkubuj zestaw płytek w temperaturze 30 °C przez cały czas trwania analizy długości życia; w dniu wysiewu oraz co dwa kolejne dni wyjmij jedną płytkę i dodawaj kroplami 0,5 ml tryptofanu, aby umożliwić wzrost żywych komórek. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez kolejne 48 do 72 godzin.Po 48 do 72 godzin należy policzyć CFU, aby ocenić żywotność w dniu dodania tryptofanu do testu w celu analizy uszkodzeń DNA i częstotliwości mutacji podczas starzenia chronologicznego. W teście CLS dla drożdży równolegle z szczepem typu dzikiego hoduje się szereg szczepów o specyficznych cechach.Częstość spontanicznych mutacji można ocenić, mierząc częstość powstawania oporności na kanawaninę w kulturze starzejącej się chronologicznie. Mutacje w genie can1, który koduje plazmatyczną permeazę argininy, sprawiają, że komórki stają się oporne na analog argininy, L-kanawaninę. Komórki oporne na kanawaninę będą rosły na płytkach z syntetycznym medium kompletnym pozbawionym argininy, uzupełnionym o siarczan L-kanawaniny. Pomiar częstości rewersji tryp+, w szczepie zawierającym mutację bursztynową w sekwencji kodującej gen trp1, pozwala na oszacowanie tempa substytucji zasad podczas chronologicznego starzenia się drożdży.Komórki z pozytywną rewersją będą rosły na płytkach z brakiem tryptofanu. Negatywny szczep lizujący EH1-50 posiada przesunięcie o +4 w otwartej ramce odczytu, co prowadaje do autofagii lizyny; może to zostać odwrócone poprzez niewielkie mutacje insercyjne lub delecyjne. Rewertanty zostaną wyselekcjonowane na płytkach z brakiem lizyny w celu wykrycia dużych reorganizacji chromosomowych (gcr).Wykorzystano szczep mutant, w którym HX T 13 zlokalizowany 7,5 kilobaz telomerycznie względem can1 na chromosomie 5 jest przerwany kasetą U3. Mutacje w obu genach, can1 i U3, czynią komórki odpowiednio opornymi na L-kanawaninę i kwas 5-fluorootarowy. Ponieważ częstotliwość mutacji punktowych występujących w obu genach jest niska, analiza częstotliwości oporności zarówno na L-kanawaninę, jak i kwas 5-fluorootarowy pozwala na oszacowanie gcr w celu monitorowania poziomu rekombinacji homologicznej i niehomologicznej. W czasie starzenia chronologicznego generowane są mutanty posiadające albo 100% homologiczne odwrócone powtórzenia, albo 91% homologiczne.Rekombinacja między sekwencjami IRS w locus his3 umożliwia ekspresję funkcjonalnego białka his3. W związku z tym komórki, w których doszło do rekombinacji, będą rosły na płytkach z pożywką pozbawioną histydyny, uzupełnionej o galaktozę. Trzeciego dnia, gdy komórki znajdą się w fazie stacjonarnej, z każdej hodowli starzejącej się zostanie pobrana odpowiednia ilość komórek.Ponieważ dla wszystkich testów stosowana jest ta sama procedura, przetworzona zostanie tylko jedna próbka. Na potrzeby tego filmu należy odwirować komórki w wirówce nakładkowej w celu uzyskania osadu. Odlać supernatant i resuspender komórki w 1 mL wody autoklawowanej.Ponownie usuń supernatant i resuspender osad komórkowy w 100 µL wody; wysiej komórki na odpowiednie płytki, aby wyselekcjonować pożądane rewerty. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C; po trzech do czterech dniach policz CFU, a następnie znormalizuj częstość mutacji do liczby żywych komórek. Ten wykres przedstawia reprezentatywne wyniki typowego testu długości życia chronologicznego, w którym przeżywalność chronologiczna komórek typu dzikiego jest porównywana z przeżywalnością mutantów S CH nine delta TOR one delta oraz RAs two delta.W hodowli płynnej mutanty pozbawione TOR1, SCH9 lub RAS2 wykazują wydłużoną chronologiczną długość życia. Co więcej, niedobory SCH9 i RAS2 wykazują efekt addytywny w promowaniu długowieczności i przeżywalności chronologicznej w obecności różnych źródeł węgla. Zastosowanie testu żywotności NC2 przedstawiono na następnym wykresie.Pierwszego dnia hodowle szczepu dzikiego SDC rozcieńczono i wysiano na płytki SC trip dropout bez źródła węgla. Płytki SC Tripp dropout uzupełnione o glukozę, etanol lub glicerol inkubowano w temperaturze 30 °C przez dwa dni. Z każdego zestawu wybrano jedną płytkę i dodano odpowiednie składniki odżywcze, aby umożliwić wzrost i tworzenie kolonii.Częstotliwość mutacji zależna od wieku znacznie różni się w zależności od szczepu, tła, manipulacji genetycznych, hodowli, warunków i wieku. Tabela ta przedstawia typowe wyniki uzyskane w szczepie typu dzikiego. Reprezentatywne wyniki syntezy ponad uszkodzeniem (trans lesion synthesis) przedstawiono na następnym obrazie.Wzrost częstotliwości mutacji zależny od wieku może wiązać się ze zmianami w błędnej naprawie DNA z wykorzystaniem ekstraktów jądrowych i różnych matryc DNA. Możemy ocenić syntezę translacyjną lub TLS w komórkach w wieku chronologicznym. Przeanalizowano ekstrakty jądrowe z trzydniowych komórek w fazie stacjonarnej typu dzikiego oraz mutantów SCH9Δ.Produkty TLS z nieuszkodzonym matrycą są oznaczone liniami ciągłymi, a produkty TLS z uszkodzoną matrycą liniami przerywanymi. W ekstraktach jądrowych z długowiecznego mutanta s CH nine delta nie zaobserwowano syntezy przez uszkodzenie; wolne primery są oznaczone otwartą strzałką. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat przeprowadzania analizy długości życia chronologicznego oraz mutacji DNA u drożdży.

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie zależnej od wieku niestabilności genomu przy użyciu chronologicznego modelu długości życia S. cerevisiae

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży.

Pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

Opisujemy tutaj działanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia ciągłe i wysokorozdzielcze obrazowanie mikroskopowe pojedynczych pączkujących komórek drożdży podczas ich pełnego okresu replikacji i/lub chronologicznego życia.

Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Szybkość mutacji w młodych komórkach Saccharomyces cerevisiae mierzona za pomocą testów fluktuacyjnych służy do przewidywania częstości mutacji dla komórek macierzystych w różnym wieku replikacji. Sortowanie magnetyczne i cytometria przepływowa są następnie wykorzystywane do pomiaru rzeczywistej częstości mutacji i wieku komórek macierzystych w celu zidentyfikowania wszelkich odchyleń od przewidywanych częstości mutacji.

Połączenie sortowania magnetycznego komórek macierzystych i testów fluktuacji w celu analizy niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych u Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji chipów mikroprzepływowych oraz konfiguracji eksperymentów mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczych komórek drożdży.

Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Platforma obrazowania "The Lifespan Machine" automatyzuje obserwację dużych populacji przez całe życie. Pokazujemy kroki wymagane do wykonania testów długości życia, odporności na stres, patogenezy i behawioralnego starzenia się. Jakość i zakres danych pozwalają naukowcom badać interwencje w procesie starzenia się pomimo obecności zmienności biologicznej i środowiskowej.

Wysokoprzepustowe testy behawioralnego starzenia się i długości życia przy użyciu maszyny Lifespan Machine

Opisujemy to test na przyczepność drożdży i inwazji agar jako miara zróżnicowania inwazyjne i pseudohyphal. Ten prosty test może być wykorzystane do oceny inwazyjnym fenotypem różnych mutantów, jak również wpływu na środowisko pamięci i szlaków sygnałowych różnicowania drożdży.

Test dla Przyczepność i Invasion Agar w S. cerevisiae

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Poznaj metodę badania niestabilności genomowej zależnej od wieku w drożdżach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu testów mutacji DNA i analizy przeżywalności. Technika ta pozwala identyfikować geny i szlaki związane z niestabilnością DNA podczas starzenia.

Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów