Badanie zależnej od wieku niestabilności genomu przy użyciu chronologicznego modelu długości życia S. cerevisiae

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie zależnej od wieku niestabilności genomu drożdży poprzez połączenie chronologicznej długości życia z zestawem prostych testów uszkodzeń DNA i mutacji. Osiąga się to poprzez pierwsze pobieranie próbek chronologicznie starzejących się kultur co dwa dni i sprawdzanie żywotności za pomocą jednostki tworzącej kolonię lub formacji CFU. Kolejnym krokiem procedury jest zbadanie mutacji DNA poprzez pobranie próbek starzejących się kultur i posiew komórek na pożywce selekcyjnej specyficznej dla mutacji.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmiany w mutacjach DNA podczas chronologicznego starzenia drożdży poprzez normalizację wyników testu mutacji do żywotności. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia, takie jak mechanizmy łączące starzenie się i niestabilność genomu w aria Aby oznaczyć chronologiczną długość życia drożdży lub CLS, najpierw zaszczepić pojedynczą kolonię drożdży w jednym mililitrze syntetycznej kompletnej glukozy lub pożywki SDC i inkubować przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza następnego dnia. Rozcieńczyć kulturę przez noc w 10 mililitrach świeżej pożywki SDC do OD 600 0,05 do 0,1, inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni.

Trzeciego dnia, gdy komórki są w fazie stacjonarnej, rozcieńczyć każdy Eloqua 10 000 razy w wodzie w autoklawie, a następnie usunąć dwie podwielokrotności po 10 mikrolitrów z kolby i umieścić 10 mikrolitrów każdej rozcieńczonej kultury na płytce A-Y-E-P-D. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż pojawią się kolonie. Liczba kolonii powstających lub jednostek tworzących kolonie od kultury trzeciego dnia jest uważana za 100% przetrwania.

Kontynuuj usuwanie podwielokrotności z leżakującej kultury w kolejnych dniach w celu posiewania. Odpowiednie dostosowanie współczynników rozcieńczenia, aby zapewnić około 20 do 100 kolonii w teście CFU. Pobieranie próbek przerywa się, gdy żywotność hodowli spadnie poniżej 1%, zazwyczaj między 11 a 13 dniem, żywotność komórek można również badać w komórkach dojrzewających na płytkach.

Aby rozpocząć ten test, zaszczepij pojedynczą kolonię w jednym mililitrze syntetycznej kompletnej pożywki glukozowej i inkubuj przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Gdy kultura urośnie do około 10 do ośmiu komórek na mililitr, rozcieńczyć kulturę wodą w autoklawie do 100 do 200 komórek na 10 mikrolitrów i 1000 komórek na 10 mikrolitrów. Dla każdego szczepu przygotuj zestaw od ośmiu do 20 płytek SDC z trytofanem oznaczonych zgodnie z gęstością posiewu.

Aby zapewnić możliwość policzenia od 10 do 100 kolonii w oczekiwaniu na zmniejszoną żywotność podczas starzenia płytki, na każdą płytkę nanieść dwie porcje po 10 do 30 mikrolitrów rozcieńczonej kultury. Inkubować płytkę ustawioną w temperaturze 30 stopni Celsjusza na czas analizy długości życia w dniu posiewu, a następnie co dwa dni, wyjąć jedną płytkę i dodawać kroplami 0,5 mililitra trytofanu, aby umożliwić wzrost żywotnych komórek. Inkubować płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dodatkowe 48 do 72 godzin.

Po 48 do 72 godzinach. Policz CFU dla żywotności w dniu edycji tryptofanu, aby oznaczyć cztery uszkodzenia DNA i częstotliwość mutacji podczas starzenia chronologicznego. Wiele dziwnych ze specjalnymi cechami jest uprawianych równolegle ze szczepem typu dzikiego do testu CLS drożdży.

Częstość spontanicznych mutacji można ocenić, mierząc częstotliwość oporności na canna vanning w chronologicznie starzejącej się kulturze. Mutacje w genie puszki one, który koduje permeazę argininy w osoczu, sprawiają, że komórki są odporne na analog argininy L Canavan Komórki oporne na argininę będą rosły po odpadnięciu argininy Syntetyczne kompletne płytki podłoża uzupełnione siarczanem L Canavan pomiar dodatniej częstotliwości odwrócenia w ruchu w szczepie zawierającym mutację bursztynową w podróży. Jedna sekwencja powlekania pozwala na oszacowanie szybkości substytucji zasad podczas chronologicznego starzenia drożdży.

Komórki dodatniej rewersji będą rosły na płytkach tryptofanu. Ujemny szczep lizozy EH one 50 zawiera przesunięcie plus cztery w otwartej ramce odczytu, co powoduje atrofię wołów dla lizyny, a można to odwrócić przez małe mutacje insercji lub delecji. Rewertanci zostaną wybrani na płytkach z odpadającą lizyną w celu wykrycia dużych rearanżacji chromosomowych lub gcr.

Stosuje się zmutowany szczep, w którym HX T 13 zlokalizowany w telomerach o długości 7,5 kilozasad do puszki pierwszej na chromosomie piątym jest zakłócany przez mutacje kasety U w trzech genach zarówno w genie puszki jeden, jak i U trzy, co czyni komórki odpornymi odpowiednio na L Canavan i pięć fluoro-kwasów orotowych. Ponieważ częstość mutacji punktowych występujących w obu genach jest niska, analiza częstości występowania oporności zarówno na El Canavan, jak i na kwas fluoro-orotowy zapewnia oszacowanie gcr w celu monitorowania poziomu rekombinacji homologicznej i homologicznej. Podczas starzenia chronologicznego generowane są mutanty, które mają albo 100% homologiczne odwrócone powtórzenia, albo 91% homologiczne.

IRS w jego trzech locus rekombinacji między IRS pozwala na ekspresję funkcjonalnego jego trzech białek. Dlatego komórki, w których zaszła rekombinacja, będą rosły na płytkach odpadających z histydyny uzupełnionych galaktozą. W trzecim dniu, kiedy komórki są w fazie stacjonarnej i odpowiednia ilość komórek zostanie usunięta z każdej starzejącej się hodowli.

Ponieważ we wszystkich testach stosuje się tę samą procedurę, przetwarzana będzie tylko jedna próbka. Na potrzeby tego filmu zmiksuj komórki, obracając je w wirówce stołowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze granulki wody w autoklawie.

Ponownie usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórek w 100 mikrolitrach komórek płytki wodnej na odpowiednich płytkach, aby wybrać pożądane przywrócenia. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza po trzech do czterech dniach, licząc CFU, częstotliwość mutacji jest znormalizowana do liczby żywotnych komórek. Ten wykres przedstawia reprezentatywne wyniki typowego chronologicznego testu długości życia, w którym chronologiczne przeżycie komórek typu dzikiego jest porównywane z przeżyciem S CH, dziewięciu delta, TOR, jednej delty i RA dwóch mutantów delta.

W płynnych kulturach mutanty pozbawione TOR jeden s, CH dziewięć lub RZA dwa wykazują wydłużoną chronologiczną długość życia. Co więcej, niedobory w s CH 9 i RA 2 wykazują addytywny wpływ na promowanie długowieczności, chronologiczne przeżycie w obecności różnych źródeł węgla. Użycie testu żywotności NC dwa pokazano na następnym wykresie.

Pierwszego dnia kultury SDC typu dzikiego rozcieńczono i posiano na płytkach SC Trip Dropout bez źródła węgla. Płytki SC Tripp z dodatkiem glukozy, etanolu lub oranów glicerolu inkubowano w temperaturze 30 stopni Celsjusza co dwa dni. Z każdego zestawu pobrano jedną płytkę i dodano odpowiednie składniki odżywcze, aby umożliwić wzrost i tworzenie kolonii.

Częstość mutacji w zależności od wieku różni się znacznie w zależności od szczepu, pochodzenia, manipulacji genetycznej, kultury, warunków i wieku. Poniższa tabela przedstawia typowe wyniki uzyskane w odmianie dzikiej. Reprezentatywne wyniki syntezy zmian trans lesion przedstawiono na kolejnym obrazie.

Zależny od wieku wzrost częstości mutacji może wiązać się ze zmianami w błędnej naprawie DNA przy użyciu ekstraktów jądrowych i różnych matryc DNA. Możemy ocenić syntezę translacyjną lub TLS w chronologicznie starzejących się komórkach. Przeanalizowano ekstrakty jądrowe z trzydniowych komórek zmutowanych w fazie stacjonarnej, typu dzikiego i SCH nine delta.

Produkty TLS z nieuszkodzonym szablonem są oznaczone liniami ciągłymi, a produkty TLS z uszkodzonym szablonem są oznaczone liniami przerywanymi. Nie zaobserwowano syntezy zmian trans w ekstraktach jądrowych z długożyciowych starterów wolnych od mutacji s CH dziewięciu delta, które są oznaczone otwartą strzałką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić chronologiczną analizę długości życia i mutacji DNA u drożdży.