Kompleksowa edycja genomu CRISPR: metoda homologii sterowanej naprawą genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu CRISPR-Cas9
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:12 min. • July 8th, 2025
Zacznij od dodania plazmidu CRISPR typu "wszystko w jednym" do komórek odpornościowych obecnych w probówce. Ten plazmid zawiera gen Cas9 w połączeniu z sekwencją kodującą sgRNA lub jednoprzewodnikowym RNA, komplementarną do sekwencji docelowej w genomie gospodarza.
Dodaj zlinearyzowany plazmid dawcy zawierający transgen umieszczony między ramionami homologicznymi lub HA - powtórzenia DNA są niezbędne do rekombinacji homologicznej. Wykonaj elektroporację, która wykorzystuje prąd elektryczny do wstrzyknięcia mieszanki plazmidowej do komórki. Po wejściu do środka przetworzone sgRNA tworzy kompleks z ekspresją nukleazy Cas9.
sgRNA wiąże miejsce docelowe, umożliwiając nukleazie Cas9 zidentyfikowanie specyficznej sekwencji rozpoznawania znanej jako motyw sąsiadujący z protospacerem lub PAM i rozszczepienie DNA gospodarza w jej pobliżu. Tworzy to tępo zakończone pęknięcie podwójnej nici, w którym maszyneria komórkowa przecina DNA, generując zwisy 3'. Obecność miejsc flankujących HA uruchamia mechanizm naprawy skierowany na homologię, w którym przecięte DNA łączy się z sekwencją HA, tworząc strukturę heterodupleksową - pętlę D.
Synteza DNA jest kontynuowana, tworząc nić komplementarną do s
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych