JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:12 min. • July 8th, 2025
Zacznij od dodania plazmidu CRISPR typu "wszystko w jednym" do komórek odpornościowych obecnych w probówce. Ten plazmid zawiera gen Cas9 w połączeniu z sekwencją kodującą sgRNA lub jednoprzewodnikowym RNA, komplementarną do sekwencji docelowej w genomie gospodarza.
Dodaj zlinearyzowany plazmid dawcy zawierający transgen umieszczony między ramionami homologicznymi lub HA - powtórzenia DNA są niezbędne do rekombinacji homologicznej. Wykonaj elektroporację, która wykorzystuje prąd elektryczny do wstrzyknięcia mieszanki plazmidowej do komórki. Po wejściu do środka przetworzone sgRNA tworzy kompleks z ekspresją nukleazy Cas9.
sgRNA wiąże miejsce docelowe, umożliwiając nukleazie Cas9 zidentyfikowanie specyficznej sekwencji rozpoznawania znanej jako motyw sąsiadujący z protospacerem lub PAM i rozszczepienie DNA gospodarza w jej pobliżu. Tworzy to tępo zakończone pęknięcie podwójnej nici, w którym maszyneria komórkowa przecina DNA, generując zwisy 3'. Obecność miejsc flankujących HA uruchamia mechanizm naprawy skierowany na homologię, w którym przecięte DNA łączy się z sekwencją HA, tworząc strukturę heterodupleksową - pętlę D.
Synteza DNA jest kontynuowana, tworząc nić komplementarną do sekwencji transgenu, dopóki nie połączy się z oryginalną nicią DNA. Górna część pętli D działa jak matryca do syntezy brakującej części DNA, generując podwójne połączenia Hollidaya - struktury, w których oddziałują na siebie cztery nici DNA. Połączenia te ustępują, a luki naprawiają się, ułatwiając wprowadzenie docelowego genu.
Przygotuj 24-dołkową płytkę zawierającą 500 mikrolitrów kompletnej pożywki wzrostowej bez antybiotyków w każdym dołku. Podgrzej płytkę w nawilżonym inkubatorze z 37 stopniami i 5% dwutlenkiem węgla. Włącz system elektroporacji. Wprowadź parametry elektroporacji dla ogniw JURKAT lub RAW.
Przygotuj mieszaninę komórka-DNA do elektroporacji. Zebrać hodowlę komórek JURKAT w kolbie o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie granulować komórki przez odwirowanie przy 90 x g przez osiem minut w temperaturze pokojowej.
Jeśli chodzi o supernatanty, do przemywania należy ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml DPBS. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową przez odwirowanie, w tych samych warunkach, co w poprzednim kroku. Usunąć DPBS i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml DPBS. Użyć 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i wymieszać z równą objętością 0,2% błękitu trypanowego.
Aby oszacować liczbę komórek, załaduj próbkę do tego slajdu zliczającego. Wstaw suwak zliczający do automatycznego licznika komórek i wyświetl obraz komórek, a następnie uzyskaj wynik zliczania komórek. Oblicz 2 miliony ogniw na 5 powtórzeń elektroporacji na eksperyment knock-in.
Przenieś wymaganą liczbę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Komórki peletowe przez odwirowanie. Aby zaoszczędzić czas, mieszaninę do elektroporacji można przygotować na etapie wirowania. Dodaj po 2,5 mikrograma każdego z wektorów CRISPR-Cas9, 2,4 mikrograma zlinearyzowanego wektora celowniczego i ponownie zawieszonego buforu R do całkowitej objętości 55 mikrolitrów w nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
Delikatnie wiruj i krótko wiruj, aby dobrze wymieszać. Przed użyciem pozostawić mieszaninę do elektroporacji w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odessać DPBS, a następnie odwirować przez dodatkowe 30 sekund. Usunąć jak najwięcej supernatantu. Ponownie zawiesić ogniwa, dodając przygotowaną mieszaninę do elektroporacji. Delikatnie pipetować w górę i w dół.
Elektroporacja: Jeśli chodzi o mieszaninę do elektroporacji komórek, użyj 10-mikrolitrowej końcówki nukleofekcyjnej z pipetą.
Ważne: Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ może to spowodować awarię elektroporacji. Naciśnij "Start".
Po elektroporacji przenieść próbkę do jednego dołka składającego się z 24-dołkowych płytek ze wstępnie podgrzaną pożywką wzrostową. Wykonaj te same procedury elektroporacji, co powyżej, na pozostałych 4 powtórzonych próbkach. Delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować komórki w inkubatorze pod kątem 37 stopni przez 48 do 72 godzin przed sortowaniem komórek FACS.