phiC31-Integraza-Medi-Site-Directed Transgene Integration: Technika mikroiniekcji do specyficznej dla miejsca integracji transgenu z wektorem Anopheles

Integraza phiC31 jest enzymem rekombinazy pochodzącym z fagów, który katalizuje specyficzną dla miejsca rekombinację transgenu, obcego genu, do genomu gospodarza. W celu integracji transgenu z gospodarzem Anopheles, należy rozpocząć od zarodka Anopheles w odpowiednim buforze.

Genom Anopheles jest wstępnie zaprojektowany z miejscem przyczepu do integracji genów i cyjanowo-fluorescencyjnym markerem do selekcji wizualnej. Następnie dodaj niewielką objętość plazmidu dawcy przenoszącego pożądany ładunek transgenu, miejsce przyczepu, czerwony marker fluorescencyjny i składniki szkieletu plazmidu do fiolki. Następnie dodaj optymalną objętość plazmidu pomocniczego przenoszącego integrazę kodującą gen. Teraz załaduj mieszaninę plazmidu do mikrostrzykawki.

Delikatnie wstrzyknij plazmidy w tylny biegun zarodka, miejsce pochodzenia komórek rozrodczych, powodując niewielki ruch cytoplazmy. Po wejściu do zarodka plazmid pomocniczy zaczyna syntetyzować enzymy integrazy.

Enzym integrazy pośredniczy w specyficznej dla miejsca rekombinacji między plazmidem dawcy a genomem gospodarza. W ten sposób transgen i czerwony marker fluorescencyjny z plazmidu dawcy integrują się w rekombinowanych miejscach przyczepu w genomie Anopheles. Następnie należy inkubować wstrzyknięty zarodek w warunkach fizjologicznych do wylęgu, z przerywanym wirowaniem.

W ciągu kilku dni z zarodka wykluwa się larwa. Pod mikroskopem fluorescencyjnym larwa Anopheles z pomyślnie zintegrowanymi genami wyraża zarówno fluorescencję cyjanową, oznaczającą genom gospodarza, jak i czerwoną fluorescencję, oznaczającą transgen z plazmidu dawcy.

Oczyść plazmidy dawcy i pomocnika za pomocą zestawu do oczyszczania bez endotoksyn. Połącz plazmid dawcy znakowany attB przenoszący interesujący nas transgen i plazmid pomocniczy przenoszący integrazę, aby uzyskać mieszaninę o końcowym stężeniu 350 nanogramów na mikrolitr plazmidu dawcy i 150 nanogramów na mikrolitr plazmidu pomocniczego.

Wytrącić DNA, dodając 0,1 objętości 3-molowego octanu sodu w 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu. Następnie wir. Biały osad powinien być natychmiast widoczny. Przemyć granulkę i ponownie zawiesić ją w buforze do wstrzykiwań, aby osiągnąć całkowite stężenie końcowe 500 nanogramów na mikrolitr. Następnie przygotuj porcje po 10 do 15 mikrolitrów każda i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Nakarm krwią 4 do 7-dniowe komary z pożądanej linii dokowania i ich dzikie odpowiedniki na 72 godziny przed mikroiniekcją. Wykonać mikroiniekcje zarodków Anopheles gambiae w 25-milimolowym chlorku sodu, kierując się na tylny biegun zarodka pod kątem 45 stopni.

Wykonaj mikroiniekcje zarodka Anopheles stephensi w oleju halowęglowym, kierując się w tylny biegun pod kątem 30 stopni. Natychmiast po wstrzyknięciu należy przenieść jaja na szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą destylowaną i przywrócić je do warunków owadobójczych. Po wykluciu należy codziennie przenosić larwy G₀ do tacy z osoloną wodą destylowaną i z powrotem do poczwarek.