Wyciszanie genów oparte na interferencji CRISPR: technika ukierunkowanego tłumienia funkcji genów w patogennej Leptospira

Interferencja CRISPR lub CRISPRi wykorzystuje dezaktywowany wariant Cas9, dCas9, do ukierunkowanego wyciszania genów, które hamują funkcję genu.

Aby wykonać CRISPRi, użyj konstruktu wektora wahadłowego - plazmidu zawierającego początki replikacji odpowiadające zarówno bakteriom E. coli, jak i Leptospira, ułatwiając rozmnażanie u obu gatunków.

Wektor zawiera również sekwencję specyficzną dla genu dCas9 i jednoprowadnicowy RNA lub sgRNA, w celu rozpoznania sekwencji docelowej.

Początkowo wektor wahadłowy jest obecny wewnątrz dawcy E. coli. Uzupełnij kulturę E. coli dawcy o Leptospira gospodarza, aby ułatwić koniugację. Koniugacja ustanawia bezpośredni kontakt międzykomórkowy między organizmami, ułatwiając wychwyt plazmidu przez Leptospira. Wewnątrz komórki konstrukt plazmidowy wytwarza sekwencje sgRNA i wyraża białka dCas9.

sgRNA zawiera region protospacerowy, który rozpoznaje swój komplementarny region docelowy na DNA Leptospira, w pobliżu motywu sąsiadującego z protospacerem lub PAM - krótkiej sekwencji rozpoznawania na DNA gospodarza. Pomaga to dCas9 utworzyć kompleks z sgRNA w miejscu docelowym poniżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji genu.

dCas9 z kompleksu sgRNA-dCas9 nie ma ak