Wyciszanie genów oparte na interferencji CRISPR: technika ukierunkowanego tłumienia funkcji genów w patogennej Leptospira

Interferencja CRISPR lub CRISPRi wykorzystuje dezaktywowany wariant Cas9, dCas9, do ukierunkowanego wyciszania genów, które hamują funkcję genu.

Aby wykonać CRISPRi, użyj konstruktu wektora wahadłowego - plazmidu zawierającego początki replikacji odpowiadające zarówno bakteriom E. coli, jak i Leptospira, ułatwiając rozmnażanie u obu gatunków.

Wektor zawiera również sekwencję specyficzną dla genu dCas9 i jednoprowadnicowy RNA lub sgRNA, w celu rozpoznania sekwencji docelowej.

Początkowo wektor wahadłowy jest obecny wewnątrz dawcy E. coli. Uzupełnij kulturę E. coli dawcy o Leptospira gospodarza, aby ułatwić koniugację. Koniugacja ustanawia bezpośredni kontakt międzykomórkowy między organizmami, ułatwiając wychwyt plazmidu przez Leptospira. Wewnątrz komórki konstrukt plazmidowy wytwarza sekwencje sgRNA i wyraża białka dCas9.

sgRNA zawiera region protospacerowy, który rozpoznaje swój komplementarny region docelowy na DNA Leptospira, w pobliżu motywu sąsiadującego z protospacerem lub PAM - krótkiej sekwencji rozpoznawania na DNA gospodarza. Pomaga to dCas9 utworzyć kompleks z sgRNA w miejscu docelowym poniżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji genu.

dCas9 z kompleksu sgRNA-dCas9 nie ma aktywności katalitycznej do rozszczepiania nici DNA, zamiast tego działa jako fizyczna bariera dla ruchu enzymu polimerazy RNA tworzącego mRNA, ostatecznie hamując transkrypcję genu. Użyj wyciszonej genowo Leptospira do dalszych badań.

W celu koniugacji komórki Leptospira są hodowane w temperaturze 29 lub 37 stopni Celsjusza w pożywce HAN. Na dzień przed koniugacją komórki E. coli dawcy hoduje się w pożywkach LB uzupełnionych kwasem diaminopimelicznym - DAP i spektynomycyną.

Następnie, w dniu koniugacji, hoduj nasycone kultury E. coli w LB plus DAP. Wewnątrz okapu bezpieczeństwa biologicznego zmontuj aparat filtracyjny, umieszczając filtr membranowy na szklanej podstawie, a następnie szklany lejek o pojemności 15 ml. Oba elementy są trzymane razem przez zacisk sprężynowy. Następnie podłącz szklankę do pompy próżniowej. Dodać 5 ml kultur Leptospira do lejka.

Następnie dodaj szczep E. coli β2163 zawierający interesujący nas plazmid. Objętość będzie się różnić w zależności od gęstości optycznej kultury. Dążymy do proporcji komórek 1:1. Obróć pompę próżniową. Teraz płyny przedostaną się przez błonę, a komórki skoncentrują się na niej.

Weź filtr i umieść go na płytce EMJH plus DAP, bakteryjną stroną do góry. Inkubować płytki w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie odzyskaj filtry z płytek i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.

Użyj 1 ml płynnego podłoża HAN, aby odzyskać komórki z filtra przez pipetowanie. Wizualizacja odzyskanych komórek za pomocą mikroskopii ciemnego pola.

Na tym etapie można zaobserwować równoważną liczbę E. coli i Leptospires. Do rozprowadzenia bakterii na dwóch płytkach HAN zawierających spektynomycynę używa się od 100 do 200 mikrolitrów. Na tym etapie DAP jest pomijany, a E. coli nie będzie rosła. Płytki inkubuje się w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 3% CO₂ . Kolonie powinny być widoczne od 8 do 10 dni.