JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:34 min • July 8th, 2025
W celu odwrotnej transfekcji małego interferującego RNA lub siRNA, klasy dwuniciowego RNA, do nieprzylegających adipocytów lub komórek tłuszczowych, należy przygotować zawiesinę siRNA ukierunkowaną na określony gen kodujący białko w adipocytach. Dodać odpowiedni odczynnik do transfekcji na bazie kationowych lipidów. Inkubować mieszaninę, aby utworzyć kompleksy transfekcyjne poprzez oddziaływania elektrostatyczne.
Przenieść mieszaninę do pokrytych kolagenem studzienek na płytce wielodołkowej. Kompleksy transfekcyjne unieruchamiają się na powłoce płytki przez niespecyficzne interakcje. Pipetować zawiesinę adipocytów do studzienek zawierających unieruchomione kompleksy transfekcyjne. Adipocyty luźno przylegają do powłoki płytki, zwiększając kontakt fizyczny między komórkami i kompleksami.
Kompleks transfekcyjny łączy się z błoną komórkową i dostarcza siRNA do cytoplazmy. SiRNA, składające się z nici antysensownej z sekwencją komplementarną do docelowego mRNA i nicią sensacyjną, jest rozpoznawane przez wielobiałkowy kompleks wyciszający indukujący RNA lub RISC. SiRNA wiąże się z RISC, a nici rozdzielają się, przy czym nić antysensowna pozostaje związana z kompleksem.
Aktywowany kompleks siRNA-RISC rozpoznaje i wiąże się z komplementarnymi miejscami na docelowym mRNA. Prowadzi to do specyficznego dla sekwencji rozszczepienia mRNA przez białko argonautu kompleksu RISC. Rozszczepione mRNA jest dalej degradowane przez maszynerię komórkową, wyciszając w ten sposób ekspresję docelowego genu.
Odpipetować siRNA ulepszoną minimalną ilością niezbędnej pożywki do wymieszania i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj odczynnik do transfekcji i ulepszone minimalne niezbędne podłoże do siRNA i odpipetuj do wymieszania. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj mieszankę transfekcyjną do każdego dołka płytki pokrytej kolagenem.
Umyj komórki na 100-milimetrowej szalce Petriego dwukrotnie za pomocą DPBS. Dodaj 5X trypsynę do komórek, upewniając się, że pokryłeś całą powierzchnię trypsyną. Odczekaj 30 sekund i ostrożnie usuń trypsynę. Inkubować szalkę Petriego przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
Następnie dotknij naczynia, aby odłączyć komórki, unikając ich uszkodzenia. Dodaj 10 mililitrów DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS i 1% penicyliny i streptomycyny, aby zneutralizować trypsynę. Ostrożnie odpipetować pożywkę w górę i w dół, aby odłączyć komórki i homogenizować zawiesinę komórek.
Policz komórki za pomocą komory liczącej Malasseza lub automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie komórek do 6,25 x 105 komórek/ml pożywki. Wysiewać 800 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na dołek płytki 12-dołkowej lub 400 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na dołek 24-dołkowej płytki zawierającej mieszaninę transfekcji.
Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych i nie przeszkadzać im przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie zastąp supernatant świeżym DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny, a następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora.