Indukowalny system regulowany Tet-Off: metoda in vitro do modulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu Tetracyklina-Off

Rozpocznij od pobrania zawiesiny hodowanych komórek biorczych w probówce. Uzupełnij probówkę indukowalnymi plazmidami zawierającymi interesujący gen. Ekspresja tego genu jest pod kontrolą sekwencji promotora połączonej z operatorem tetracykliny lub TetO, tworząc element reagujący na tetracyklinę lub TRE.

Dodatkowo dodaj regulatorowe wektory tetracyklinowe, z których każdy zawiera gen kodujący rekombinowane białko transaktywatora tetracykliny lub tTA. Elektroportuj mieszaninę komórka-DNA, aby użyć impulsów elektrycznych w celu ułatwienia wychwytu plazmidów przez komórkę.

Po elektroporacji płytki komórek i inkubować przez żądany czas. Po wejściu do jądra wektor tetracykliny off ulega ekspresji białka tTA. tTA jest białkiem hybrydowym zawierającym represor Tet lub ugrupowanie TetR i wirusową domenę transaktywatora transkrypcji VP16.

Ugrupowanie TetR wiąże sekwencję TetO elementu TRE, podczas gdy domena VP16 umożliwia polimerazie RNA syntezę mRNA z dalszego DNA, co ostatecznie prowadzi do ekspresji genu. Zastąp pożywkę wzrostową na płytce hodowlanej pożywką zawierającą doksycyklinę i inkubuj.

Doksycyklina - syntetyczny analog tetracykliny - wiąże się z białkiem TetR i zmienia jego konformację. Zmiana ta zaburza oddziaływanie białka TetR z sekwencją TetO, hamując ekspresję genu docelowego.

Zasiać komórki na 1 x 10⁶ komórek/^cm2 na 100-milimetrowych szalkach Petriego, w obecności kompletnej minimalnej niezbędnej pożywki. Hodowla przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przy wilgotności. Następnego dnia dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki bez antybiotyku do każdego dołka nowej 12-dołkowej płytki i podgrzej płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Podczas tej inkubacji dodaj 1 mikrogram plazmidu odpowiedzi i 1 mikrogram wektora regulatorowego do jednej 1,5-mililitrowej probówki na studzienkę. Przemyj komórki nabłonka pęcherzyków płucnych 10 mililitrami na studzienkę PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wapnia lub magnezu i potraktuj komórki 5 mililitrami na studzienkę 37 stopni Celsjusza 0,05% trypsyny przez dwie do czterech minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Gdy komórki się odłączą, zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 mililitrów na dołek kompletnego podłoża bez antybiotyku i zbierz komórki do nowej 50-mililitrowej probówki. Umyj naczynie 4 mililitrami świeżej pożywki, aby zebrać pozostałe komórki i osadnić komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze PBS w celu policzenia i ponownie odwirować komórki. Ponownie zawiesić osad o gęstości 4 x 10⁷ komórek/ml buforu do respensji i dodać 4 x 10⁵ komórek do każdej probówki plazmidu i wektora, delikatnie mieszając. Umieść 1 probówkę w urządzeniu do elektroporacji i napełnij probówkę 3,5 mililitra buforu elektrolitycznego.

Całkowicie wciśnij tłok, aby włożyć pozłacaną końcówkę elektrody do pipety i delikatnie wymieszaj zawartość probówki. Ostrożnie zassać komórki pipetą i włożyć pipetę do stacji elektroporacji, aż usłyszysz kliknięcie. Wybierz odpowiedni protokół elektroporacji dla komórek nabłonka pęcherzyków płucnych i naciśnij Start na ekranie dotykowym.

Natychmiast po transfekcji wyjąć pipetę i przenieść komórki do jednego dołka podgrzanej płytki 12-dołkowej. Gdy wszystkie komórki zostaną poddane elektroporacji i platerowane, umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, zastępując supernatant w każdym dołku kompletnym podłożem z antybiotykami po dwóch dniach. Powodzenie transfekcji można potwierdzić przez ekspresję EGFP, obserwowaną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej z wykorzystaniem wektora kontrolnego.

Aby zahamować transkrypcję interesującego genu, 72 godziny po transfekcji zastąp supernatant 1 mililitrem na studzienkę kompletnej pożywki uzupełnionej 1 mikrogramem na mililitr świeżo przygotowanej doksycykliny. Aby ocenić okres półtrwania mRNA interesującego genu, należy umieścić płytkę w inkubatorze hodowli komórkowej z 15 minut do 6 godzin.

Mycie jednej studzienki 1 mililitrem lodowatego PBS, przed lizą komórek za pomocą 500 mikrolitrów buforu do lizy z dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji fenolowo-chloroformowego RNA i delikatne wstrząsanie w każdym eksperymentalnym punkcie czasowym. Następnie wyizoluj RNA zgodnie z instrukcjami zestawu i określ wydajność i czystość RNA za pomocą spektrofotometrii przy 230, 260 i 280 nanometrach.