Indukowalny system regulowany Tet-Off: metoda in vitro do modulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu Tetracyklina-Off
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 6:19 min. • July 8th, 2025
Rozpocznij od pobrania zawiesiny hodowanych komórek biorczych w probówce. Uzupełnij probówkę indukowalnymi plazmidami zawierającymi interesujący gen. Ekspresja tego genu jest pod kontrolą sekwencji promotora połączonej z operatorem tetracykliny lub TetO, tworząc element reagujący na tetracyklinę lub TRE.
Dodatkowo dodaj regulatorowe wektory tetracyklinowe, z których każdy zawiera gen kodujący rekombinowane białko transaktywatora tetracykliny lub tTA. Elektroportuj mieszaninę komórka-DNA, aby użyć impulsów elektrycznych w celu ułatwienia wychwytu plazmidów przez komórkę.
Po elektroporacji płytki komórek i inkubować przez żądany czas. Po wejściu do jądra wektor tetracykliny off ulega ekspresji białka tTA. tTA jest białkiem hybrydowym zawierającym represor Tet lub ugrupowanie TetR i wirusową domenę transaktywatora transkrypcji VP16.
Ugrupowanie TetR wiąże sekwencję TetO elementu TRE, podczas gdy domena VP16 umożliwia polimerazie RNA syntezę mRNA z dalszego DNA, co ostatecznie prowadzi do ekspresji genu. Zastąp pożywkę wzrostową na płytce hodowlanej pożywką zawierającą doksycyklinę i inkubuj.
Doksycyklina - syntetyczny analog tetracykliny - wiąże się z białkiem TetR i zmienia jego konf
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych