JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:40 min • July 8th, 2025
Zacznij od żywotnych, jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego umieszczonych w studzienkach formy do mikroiniekcji.
Załadować igłę do mikroiniekcji roztworem zawierającym mRNA kodujące transpozazę Tol2 i plazmidy dawcy transpozonów. Plazmidy zawierają wszechobecny promotor danio pręgowanego i gen kodujący białka fluorescencyjne otoczony ramionami transpozonów Tol2.
Ostrożnie wstrzyknąć roztwór do mikroiniekcji do cytoplazmy zarodka danio pręgowanego. W komórce mRNA transpozazy Tol2 przekształcają się w białka transpozazy Tol2 i są aktywnie transportowane do jądra.
Miejsca Tol2 na plazmidzie dawcy zawierają specyficzne odwrócone powtórzenia końcowe lub ITR, flankujące gen reporterowy. ITR-y są otoczone krótkimi, bezpośrednimi powtórzeniami. Białka transpozazy rozpoznają miejsca ITR i wiążą się z nimi, tworząc spinkę do włosów na flankującym DNA. Transpozazy dalej rozszczepiają konstrukt transpozonu od flankującego DNA, uwalniając go z plazmidu i pozostawiając krótkie, bezpośrednie powtórzenia.
Transpozazy tworzą rozłożone w czasie dwuniciowe pęknięcie w genomie komórki somatycznej i wprowadzają konstrukt transpozonu do miejsca genomu. Wypełnienie szczeliny na rozłożonych końcach przez polimerazę DNA, a następnie ligacja nacięć tworzy krótkie, bezpośrednie powtórzenia.
Podwiązanie powoduje integrację stabilnego konstruktu transpozonu z genomem komórki somatycznej, a promotor ułatwia ekspresję białek fluorescencyjnych. Inkubować wstrzyknięte zarodki. Podczas rozwoju embrionalnego komórki somatyczne dają początek różnym typom komórek i tworzą transgenicznego danio pręgowanego.
Po przygotowaniu mRNA transpozazy Tol2 i roztworu do wstrzykiwań, zgodnie z protokołem tekstowym, po południu przed wstrzyknięciem należy założyć od czterech do sześciu zbiorników hodowlanych z co najmniej dwoma samcami i dwiema samicami. Aby zmniejszyć ilość odpadów rybnych i wywołać reakcję hodowlaną, unikaj karmienia ryb po południu.
Następnego ranka należy wyjąć przygotowany roztwór do wstrzykiwań z zamrażarki o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza i umieścić go na lodzie. Pociągnij przegrody w zbiornikach hodowlanych ryb i pozwól rybom na łączenie się w pary. Ogólnie rzecz biorąc, ryby składają jaja w ciągu 20 do 30 minut.
W oczekiwaniu, za pomocą ściągacza do mikropipet o następujących parametrach, wyciągnij igły ze szkła kapilarnego. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby złamać koniec igły i utworzyć skośną krawędź. Mniejsza średnica jest preferowana w celu zmniejszenia śmiertelności zarodków.
Gdy ryby złożą jaja, zbierz je na szalkę Petriego o średnicy 10 centymetrów. Natychmiast pod mikroskopem preparacyjnym usuń wszystkie nieprawidłowe zarodki i odchody rybne. Następnie pipetować zapłodnione zarodki do przygotowanej 3% formy iniekcyjnej agarozy. Usuń nadmiar wody, aby pomóc utrzymać zarodki na miejscu.
Gdy wszystkie rzędy zostaną wypełnione żywotnymi zarodkami, ułóż je tak, aby wszystkie pojedyncze komórki były zorientowane pod kątem 45 stopni w poziomie w stosunku do igły. To znacznie ułatwi późniejsze wstrzykiwanie. Następnie, w rękawiczkach, za pomocą końcówki do pipety o pojemności 20 mikrolitrów usuń 5 mikrolitrów przygotowanej konstrukcji z rurki na lodzie.
Ostrożnie włóż końcówkę pipety do tylnego końca pękniętej rurki kapilarnej do miejsca, w którym zaczyna się zwężać, aby odczynnik znalazł się jak najbliżej końcówki i wypchnął go do kapilary. Jeśli nadal znajdują się pęcherzyki powietrza, potrząśnij igłą, uważając, aby nie złamać końcówki.
Włóż igłę prosto do uchwytu igły do mikroiniekcji i ostrożnie dokręć, aż igła pozostanie na swoim miejscu, a następnie wyreguluj kąt do około 45 stopni. Po przygotowaniu i założeniu igły włącz mikroskop i zbiornik z gazem. Wyreguluj objętość wstrzyknięcia, używając około 0,5 PSI do podtrzymywania i 30 PSI do wyrzucania.
Sprawdź, czy roztwór wysuwa się z igły po naciśnięciu pedału. Za pomocą mikrometru stopniowego z kroplą oleju mineralnego dostosuj objętość i przepływ roztworu do około 10 mikrometrów średnicy. Upewnij się, że ciśnienie wsteczne pozwala na wypłynięcie niewielkiej ilości roztworu z igły.
Jeśli nie ma wystarczającego ciśnienia wstecznego, działanie kapilarne spowoduje, że płyn dostanie się do igły i zniszczy mRNA. Po skalibrowaniu igły włóż igłę do pojedynczej komórki zapłodnionych zarodków, używając krawędzi nacięcia żelowego, aby zapewnić podkład, który utrzymuje zarodek na miejscu i umożliwia wywieranie nacisku przez igłę bez przesuwania zarodka.
Gdy końcówka igły znajdzie się w pojedynczej komórce, naciśnij pedał, aby uwolnić żądaną ilość roztworu. Ważne jest, aby wstrzyknąć roztwór do komórki, a nie żółtko do wytworzenia transgenicznego danio pręgowanego. Powtórz ten proces dla wszystkich zarodków.
Po zakończeniu użyj jednorazowej pipety transferowej o pojemności 3,4 mililitra i wody z systemu rybnego, aby przenieść wstrzyknięte zarodki do oznakowanego naczynia, wypłukując je z nacięcia agarozy. Przechowuj zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aby mogły się rozwijać.