JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:40 min. • July 8th, 2025
Zacznij od żywotnych, jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego umieszczonych w studzienkach formy do mikroiniekcji.
Załadować igłę do mikroiniekcji roztworem zawierającym mRNA kodujące transpozazę Tol2 i plazmidy dawcy transpozonów. Plazmidy zawierają wszechobecny promotor danio pręgowanego i gen kodujący białka fluorescencyjne otoczony ramionami transpozonów Tol2.
Ostrożnie wstrzyknąć roztwór do mikroiniekcji do cytoplazmy zarodka danio pręgowanego. W komórce mRNA transpozazy Tol2 przekształcają się w białka transpozazy Tol2 i są aktywnie transportowane do jądra.
Miejsca Tol2 na plazmidzie dawcy zawierają specyficzne odwrócone powtórzenia końcowe lub ITR, flankujące gen reporterowy. ITR-y są otoczone krótkimi, bezpośrednimi powtórzeniami. Białka transpozazy rozpoznają miejsca ITR i wiążą się z nimi, tworząc spinkę do włosów na flankującym DNA. Transpozazy dalej rozszczepiają konstrukt transpozonu od flankującego DNA, uwalniając go z plazmidu i pozostawiając krótkie, bezpośrednie powtórzenia.
Transpozazy tworzą rozłożone w czasie dwuniciowe pęknięcie w genomie komórki somatycznej i wprowadzają konstrukt transpozonu do miejsca genomu. Wypełnienie szczeliny na rozłożonych końcach
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych