JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:29 min. • July 8th, 2025
Rozpocząć od zawieszenia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, hiPSC, w odpowiednim buforze do elektroporacji. Dodać roztwór składający się z plazmidów kodujących transpozazę PiggyBac i plazmidów dawcy. Elektroporować mieszaninę.
Impulsy elektryczne przejściowo przenikają przez błony komórkowe, ułatwiając komórkowy wychwyt plazmidów. Plazmidy dawcy składają się ze specyficznych dla transpozonów odwróconych powtórzeń końcowych, ITR, które są odwróconymi uzupełnieniami względem siebie, otoczonymi powtórzeniami TTAA nawiasującymi docelowe geny oporności na białko i antybiotyki.
Eksprymowane białka transpozazy PiggyBac tworzą nacięcia na końcach 3' ITR, wewnętrzne dla powtórzeń TTAA. Odsłonięte grupy 3'-hydroksylowe atakują nukleotyd nici komplementarnej wewnątrz flankującego DNA, tworząc spinki do włosów TTAA na końcach transpozonu, uwalniając w ten sposób konstrukt transpozonu z plazmidu.
Transpozazy rozwiązują spinki do włosów, tworząc zwisy TTAA na końcach 5' konstruktu transpozonu. Transpozazy dalej tworzą dwuniciowe pęknięcia w sekwencji TTAA w genomie gospodarza. Uwolnione końce transpozonu 3'-hydroksylowego atakują sekwencję TTAA na rozłożonych końcach, powodując kowalencyjne połączenie konstruktu transpozonu z genomem gospodarza, pozostawiając jednoniciowe luki po bokach konstruktu transpozonu. Te luki w DNA gospodarza są ligowane, co prowadzi do stabilnej integracji konstruktu transpozonu.
Potraktuj hiPSC wysiane na płytce pokrytej białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej pożywką zawierającą antybiotyki. Gen oporności na antybiotyki, napędzany przez promotor przed nim, umożliwia selekcję komórek z edytowanym genem.
Przepłukać ludzką hodowlę iPSC PBS bez wapnia i magnezu, a następnie potraktować komórki odczynnikiem do dysocjacji komórek przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki zaczną odłączać się od pojemnika hodowlanego, użyj pipety P1000, aby delikatnie ręcznie oddzielić komórki od 3 do 4 razy.
Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i doprowadź końcową objętość do 10 mililitrów świeżym PBS bez wapnia i magnezu w celu policzenia. Zbierz 1 x 106 komórek przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu R z zestawu do elektroporacji.
Dodać 4,5 mikrograma transpozycyjnego wektorowego plazmidowego DNA i 0,5 mikrograma transpozazy plazmidowej DNA transpozazy PiggyBac do transfekcji. Transfekcja z systemem elektroporacji ogniw zgodnie z instrukcją producenta, o wskazanych parametrach. Wtedy. Wysiewaj komórki w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK Y-27632 w 6-milimetrowym naczyniu pokrytym matrycą.