JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:29 min. • July 8th, 2025
Rozpocząć od zawieszenia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, hiPSC, w odpowiednim buforze do elektroporacji. Dodać roztwór składający się z plazmidów kodujących transpozazę PiggyBac i plazmidów dawcy. Elektroporować mieszaninę.
Impulsy elektryczne przejściowo przenikają przez błony komórkowe, ułatwiając komórkowy wychwyt plazmidów. Plazmidy dawcy składają się ze specyficznych dla transpozonów odwróconych powtórzeń końcowych, ITR, które są odwróconymi uzupełnieniami względem siebie, otoczonymi powtórzeniami TTAA nawiasującymi docelowe geny oporności na białko i antybiotyki.
Eksprymowane białka transpozazy PiggyBac tworzą nacięcia na końcach 3' ITR, wewnętrzne dla powtórzeń TTAA. Odsłonięte grupy 3'-hydroksylowe atakują nukleotyd nici komplementarnej wewnątrz flankującego DNA, tworząc spinki do włosów TTAA na końcach transpozonu, uwalniając w ten sposób konstrukt transpozonu z plazmidu.
Transpozazy rozwiązują spinki do włosów, tworząc zwisy TTAA na końcach 5' konstruktu transpozonu. Transpozazy dalej tworzą dwuniciowe pęknięcia w sekwencji TTAA w genomie gospodarza. Uwolnione końce transpozonu 3'-hydroksylowego atakują sekwencję TTAA na rozłożonych
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych