JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:13 min • July 8th, 2025
Aby jednocześnie wyeliminować wiele genów za pomocą systemu CRISPR-concatemer-Cas9, zacznij od rurki zawierającej zawiesinę komórek jelitowych myszy. Uzupełnij probówkę wektorami CRISPR-concatemer zawierającymi kasetę ekspresyjną dla wielu przewodników RNA lub gRNA, zintegrowanych obok siebie.
Każda kaseta gRNA jest specjalnie projektowana, aby indywidualnie wyeliminować zamierzony gen. Dodaj wektory ekspresji kodujące endonukleazę Cas9 do tej samej probówki. Elektroportuj mieszaninę komórka-plazmid - technika, która wykorzystuje prąd elektryczny w celu ułatwienia wejścia plazmidów do komórki. Wewnątrz komórki koekspresja konkatelera CRISPR i wektora Cas9 tworzy odpowiednio sekwencje gRNA i nukleazy Cas9.
Każda sekwencja gRNA wiąże się z odpowiednim enzymem Cas9, tworząc wiele kompleksów Cas9-gRNA, które przyłączają się do docelowych miejsc w genomie gospodarza. To wiązanie aktywuje enzym Cas9, który wytwarza nacięcie w obu niciach DNA przed miejscem sąsiadującego z motywem protospacerowym lub PAM. Powoduje to pęknięcie dwuniciowe lub DSB w docelowym DNA.
W przypadku braku jakiejkolwiek sekwencji homologicznej do genu docelowego, uruchamiany jest endogenny mechanizm naprawczy komórki, zwany niehomologicznym łączeniem końców, umożliwiając białkom naprawczym i cząsteczkom kinazy związanie się w miejscu pęknięcia. Później enzym ligazy naprawia DSB, co powoduje modyfikacje docelowej sekwencji genu. Modyfikacje te zaburzają funkcję genów, powodując nokaut wielu genów.
Rozpocznij tę procedurę od dodania 9 mililitrów zredukowanej pożywki surowicy do 15-mililitrowej probówki zawierającej zawiesinę komórkową i odwiruj w 400G przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć cały supernatant i ponownie zawiesić osad w roztworze do elektroporacji. Dodaj łączną ilość 10 mikrogramów DNA do dwóch nowych probówek. Następnie dodaj roztwór do elektroporacji do końcowej objętości 100 mikrolitrów i trzymaj mieszaninę komórka-DNA na lodzie.
Przenieś mieszaninę komórka-DNA do kuwety do elektroporacji. Umieść kuwetę w komorze elektroporatora. Zmierz impedancję, naciskając odpowiedni przycisk na elektroporatorze i upewnij się, że wynosi od 0,030 do 0,055 oma. Wykonaj elektroporację zgodnie z ustawieniami wskazanymi w protokole tekstowym. Dodaj 400 mikrolitrów buforu do elektroporacji i inhibitora ROCK do kuwety, a następnie przenieś całą jej zawartość do 1,5-mililitrowej probówki.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby komórki mogły się zregenerować. Po 30 minutach wiruj z prędkością 400G przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 mikrolitrach na studzienkę matrycy piwnicznej. Wysiewaj około 1 x 104 do 1 x 105 komórek na studzienkę na 48-dołkową płytkę i dodaj EGF plus inhibitor Noggin GSK-3, inhibitor ROCK i 1,25% pożywki dimetylosulfotlenku. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza.