JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:26 min. • July 8th, 2025
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej lub PBMC to krwinki krążące z pojedynczymi, dużymi jądrami, składającymi się z limfocytów B i T, komórek NK, monocytów i komórek dendrytycznych. PBMC przechowują nadwyżkę glukozy w postaci polimerowej w postaci glikogenu - rozgałęzionego polisacharydu - w swojej cytoplazmie.
Aby wykryć obecność glikogenu w PBMC, należy przygotować jednolity rozmaz wyizolowanych PBMC na szkiełku podstawowym. Potraktuj komórki formaliną - roztworem utrwalającym, który sieciuje biomolekuły komórkowe, zachowując integralność strukturalną PBMC.
Częściowo zanurz szkiełko w roztworze amylazy. Enzym ten wnika do komórek i hydrolizuje glikogen w leczonych komórkach. W ten sposób powstają dwie odrębne populacje komórek - komórki bogate w glikogen leczone enzymami i nieleczone amylazą, bogate w glikogen
.Załóż je roztworem kwasu periodycznego, który oksydacyjnie przekształca grupy hydroksylowe cząsteczek glikogenu w aldehydy.
Opłucz szkiełko w wodzie, aby zatrzymać reakcję utleniania i usunąć nadmiar kwasu okresowego. Potraktuj szkiełko odczynnikiem Schiffa, który reaguje z grupami aldehydowymi glikogenu traktowanego kwasem okresowym, tworząc nierozpuszczalny kompleks o barwie purpurowej.
Zastosuj nośnik montażowy, aby unieruchomić komórki podczas obrazowania. Umieść szkiełko nakrywkowe, aby rozprowadzić nośnik montażowy na całej powierzchni szkiełka, aby uzyskać lepszą wizualizację. Zobrazuj poplamione komórki.
Komórki niepoddane działaniu amylazy zawierają granulki glikogenu purpurowego, nieobecne w komórkach traktowanych enzymami.
W tym kroku umieść szkiełko na płaskiej powierzchni. Nałóż 2 mililitry roztworu kwasu okresowego na próbkę i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie kilkakrotnie przepłucz szkiełko wodą destylowaną. Nałóż 2 mililitry odczynnika Schiffa na szkiełko i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Następnie umyj szkiełko wodą destylowaną przez 5 minut, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie nałóż na szkiełko o grubości 100 mikrolitrów i przykryj je jednym dużym szkiełkiem nakrywkowym lub nałóż 50 mikrolitrów i użyj dwóch małych szkiełek nakrywkowych. Następnie nałóż bezbarwny lakier do paznokci na krawędziach szkiełka nakrywkowego. Pozostaw je do wyschnięcia na noc.
Następnie uzyskaj obrazy za pomocą mikroskopu Binocular Light za pomocą obiektywu 100X.