JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:15 min. • July 8th, 2025
Siarczanowane glikozaminoglikany, GAG, są długimi, ujemnie naładowanymi, liniowymi polisacharydami z powtarzającymi się łańcuchami jednostek disacharydowych zasiarczonymi w różnych pozycjach, występującymi w różnych długościach.
Aby uwidocznić izolowane zasiarczone GAG o znaczeniu różniącym się długością łańcucha w żelu poliakrylamidowym po elektroforezie, ostrożnie wyjmij żel z kasety. Spłucz wodą dejonizowaną, usuwając dołączone kawałki żelu, które mogą zakłócać barwienie.
Potraktuj kwaśnym roztworem błękitu alckiego. W kwaśnych warunkach błękit alcyjny, wielowartościowy barwnik kationowy z atomem miedzi w środku, specyficznie oddziałuje z ujemnie naładowanymi siarczanowymi GAG poprzez oddziaływania jonowe, tworząc ciemnoniebieski kompleks nierozpuszczalny w wodzie.
Umyj żel wodą dejonizowaną i metanolem, usuwając wszelkie pozostałości plam. Inkubować żel z alkalicznym roztworem azotanu srebra. W warunkach alkalicznych alcyjskie siarczanowane GAG związane z błękitem zapewniają miejsca dla dodatnio naładowanych jonów srebra do wiązania się i tworzenia kompleksu.
Żel należy traktować w roztworze rozwijającym zawierającym formaldehyd i kwas cytrynowy. Kwas cytrynowy obniża lokalne pH w celu uzyskania optymalnej aktywności formaldehydu, który redukuje jony srebra do nierozpuszczalnego metalicznego srebra w zasiarczonych fragmentach GAG, wzmacniając niebieski sygnał alcyjski.
Dodaj roztwór zatrzymujący, aby obniżyć pH, zapobiegając redukcji jonów srebra w celu zminimalizowania barwienia tła. Teraz wyobraź sobie żel.
Alciańsko-srebrne, zabarwione siarczanowanymi pasmami fragmentów GAG wydają się ciemnobrązowe lub czarne, co umożliwia bardzo czułą wizualizację i określenie długości izolowanych łańcuchów polimerowych GAG.
Po zakończeniu biegu zdemontuj kasetę i ostrożnie wyekstrahuj żel do dużego, czystego pojemnika wypełnionego dejonizowaną, przefiltrowaną wodą. Następnie wylej wodę i zabarwij żel w roztworze barwiącym Alcian blue przez pięć minut. Wyrzuć niebieską plamę Alcian i szybko umyj dwa do trzech razy dejonizowaną, przefiltrowaną wodą, aż większość roztworu do barwienia niebieskiego Alcian zostanie usunięta.
Zabarwić żel w roztworze barwiącym azotanu srebra w świeżym, czystym pojemniku przez 30 minut. Następnie umyj dwa do trzech razy przez 30 minut w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie, aby całkowicie usunąć roztwór barwiący srebro. Wylej wodę i dodaj rozwijający się roztwór.
Uważnie obserwuj żel pod kątem wyglądu pasm. W zależności od jakości plamy i masy załadowanej próbki, wywołanie może trwać od kilku sekund do kilku minut. Gdy tylko pożądane pasma staną się widoczne, natychmiast wyrzuć rozwijający się roztwór i krótko przemyj żel roztworem zatrzymującym.