JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:15 min • July 8th, 2025
Siarczanowane glikozaminoglikany, takie jak siarczany heparanu, HS, są ujemnie naładowanymi, liniowymi, siarczanowymi polisacharydami o zmiennej długości łańcuchów, przyłączonymi do białek powierzchniowych komórek.
Aby oszacować różnej długości HS wyizolowane z tkanki płucnej myszy, zacznij od złożenia kasety żelowej. Częściowo wypełnij go wysoko stężonym roztworem akryloamidu-bisakryloamidu, w tym środkami katalizującymi - nadsiarczanem amonu i tetra-metylo-etylenodiaminą. Pokryć wodą, aby zapobiec kontaktowi z powietrzem, co może hamować polimeryzację. Inkubować.
Czynniki katalizujące indukują polimeryzację akrylamidowo-bisakryloamidową, tworząc żel o małej rozdzielczości porów. Wylej wodę. Dodać roztwór akryloamidu-bisakryloamidu o niskim stężeniu ze środkami katalizującymi. Włóż grzebień żelowy, aby stworzyć dołki. Roztwór polimeryzuje, tworząc żel do układania w stosy o dużych porach.
Załaduj komory zbiornika do elektroforezy buforem roboczym, aby zapewnić optymalną przewodność elektryczną podczas elektroforezy.
Rozpuścić mieszaninę HS w buforze ładującym zawierającym barwnik śledzący i sacharozę. Następnie przenieś tę mieszaninę i standardowe drabinki HS do studzienek kasetowych. Sacharoza ogranicza mieszaninę do studzienek. Barwnik pomaga monitorować postęp elektroforezy.
Rozpocznij elektroforezę przy niskim napięciu. Ujemnie naładowane HS przechodzą przez żel układający się, poruszając się w kierunku dodatnio naładowanej anody i koncentrują się na granicy faz żelu układającego się w stos i rozwiązującego z powodu różnicy wielkości porów.
Zwiększ napięcie. Niskołańcuchowe HS szybko migrują przez rozdzielczy żel, przemieszczając się dalej, podczas gdy długołańcuchowe HS zostają uwięzione w matrycy żelowej i poruszają się powoli.
Po elektroforezie zabarwić żel. HS pojawiają się jako odrębne pasma, przy czym HS o małych łańcuchach są umieszczone niżej niż HS o długich łańcuchach. Długość poszczególnych HS można określić przez porównanie ze standardami HS.
Zacznij od umieszczenia pustej kasety w zbiorniku PAGE. Odlać żel rozdzielczy, mieszając 10 mililitrów roztworu żelu rozdzielczego z 60 mikrolitrami świeżo przygotowanego 10% nadsiarczanu amonu w 15-mililitrowej probówce. Następnie dodaj 10 mikrolitrów TEMED. Delikatnie odwróć rurkę 2 do 3 razy.
Szybko dodaj 10 mililitrów aktywowanego roztworu żelu poliakrylamidowego do kasety za pomocą pipety. Nałożyć 2 mililitrami dejonizowanej przefiltrowanej wody i pozostawić rozdzielczy żel do polimeryzacji przez 30 minut.
Po pełnej polimeryzacji żelu rozdzielczego wylej nałożoną wodę. Odlać żel do układania, mieszając 3 mililitry roztworu żelu do układania w stos z 90 mikrolitrami świeżo przygotowanego 10% nadsiarczanu amonu w 15-mililitrowej probówce. Następnie dodaj 3 mikrolitry TEMED i delikatnie odwróć probówkę 2 do 3 razy.
Za pomocą pipety szybko dodaj roztwór żelu do układania w stos na zestalony żel rozdzielczy, aż kaseta zostanie wypełniona po brzegi. Całkowicie włóż grzebień dołączony do pustej kasety z żelem poliakrylamidowym i pozwól żelowi do polimeryzacji przez 30 minut. Po spolimeryzowaniu żelu usuń pasek taśmy z dna kasety i umieść kasetę z powrotem w zespole zbiornika PAGE. Napełnij górną i dolną komorę odpowiednimi roztworami buforowymi.
Rozpuścić wysuszone próbki glikozaminoglikanu w minimalnej niezbędnej objętości zdejonizowanej, przefiltrowanej wody i wymieszać z buforem ładującym próbkę w stosunku 1 do 1. Załadować próbki i drabinki oligosacharydowe HS do żelu.
Ponownie uruchom żel przez 5 minut przy napięciu 100 woltów. Następnie uruchom go przy napięciu 200 V przez 20 do 100 minut, w zależności od procentowej zawartości akrylamidu w roztworze żelu rozdzielczego.