JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:10 min. • July 8th, 2025
Rozpocząć od potraktowania próbki białka buforem denaturującym zawierającym detergent - dodecylosiarczan sodu, SDS i środek redukujący - beta-merkaptoetanol. Podgrzej go krótko. Na tym etapie beta-merkaptoetanol przerywa wiązania dwusiarczkowe, nadając białku rozwiniętą konformację.
Rozwinięte białka z odsłoniętymi aminokwasami hydrofobowymi wiążą się z ujemnie naładowanym SDS i uzyskują jednorodny ładunek ujemny. Dodaj odpowiedni barwnik śledzący do próbki, aby uzyskać wizualizację w czasie rzeczywistym.
Teraz załaduj próbkę i standardowy marker wielkości cząsteczki do oddzielnych studzienek obecnych w żelu do układania w stos - górnej warstwie żelu poliakrylamidowego zawierającej niższe stężenie usieciowanych polimerów akryloamidu.
Podłącz aparat żelowy wypełniony buforem do zasilania.
W obecności pola elektrycznego ujemnie naładowane białka swobodnie migrują w kierunku anody i układają się razem, aby dostać się do żelu rozdzielczego - dolnej warstwy zawierającej żel o wyższym stężeniu.
W żelu rozdzielczym białka zaczynają migrować zgodnie z ich wielkością cząsteczkową, przy czym mniejsze białka migrują szybko, co skutkuje optymalnie rozwiązanymi prążkami białkowymi. Następnie przerwij bieg i usuń żel.
Zabarwić żel anionowym barwnikiem Coomassie blue, który wiąże się elektrostatycznie z podstawowymi aminokwasami w białkach, nadając im niebieskie zabarwienie. Następnie odbarwić żel w roztworze kwasu octowego, aby uzyskać lepszą wizualizację.
Usuń żel i zidentyfikuj oddzielone białka na podstawie ich szacowanej masy cząsteczkowej.
Przygotować dwa żele separujące zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Wlej żel między szklane płytki za pomocą 1-mililitrowej pipety, upewniając się, że górne 2 centymetry są wolne od mieszaniny. Dodaj 70% etanolu na wierzch żelu separującego, tworząc równomierne połączenie między dwiema warstwami.
Po polimeryzacji żeli separujących należy je przygotować, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w rękopisie tekstowym. Następnie usuń etanol z żeli separujących i dodaj roztwór żelu do układania w stosy. Ostrożnie włóż grzebień z żądaną liczbą kieszeni, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza i pozwól żelowi polimeryzować przez 20 do 30 minut.
Załaduj 4 mikrolitry każdej próbki, a także drabinkę białkową, do oddzielnych studzienek. Następnie uruchom żel w buforze Tris-Glycine o napięciu 144 woltów przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Użyj wstępnie podgrzanego roztworu Fairbanks A, aby zabarwić żele na bujaku przez 30 minut, i wstępnie podgrzanego roztworu Fairbanksa D, aby odbarwić żele na bujaku, aż do uzyskania pożądanego tła.