JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:34 min • July 8th, 2025
Na początek weź próbkę zawierającą fluorescencyjnie znakowane fosforylowane i niefosforylowane oligonukleotydy RNA zmieszane z barwnikiem ładującym zawierającym mocznik. Podgrzać próbkę.
Mocznik - silny denaturant - w połączeniu z ciepłem denaturuje drugorzędową strukturę RNA, w wyniku czego powstaje jego zlinearyzowana i nieustrukturyzowana konformacja. Teraz odlej żel, mieszając roztwór akrylamidu-bisakryloamidu z mocznikiem.
Dodaj tetrametylenodiaminę, katalizator i nadsiarczan amonu, środek utleniający, aby ułatwić późniejszą polimeryzację żelu.
Wlej roztwór do wstępnie zmontowanego aparatu kasetowego. Włóż grzebień, tworząc dołki do ładowania próbki. Pozwól żelowi spolimeryzować. Umieść kasetę w aparacie żelowym. Dodaj bufor do pracy do górnego i dolnego zbiornika, utrzymując przepływ prądu przez cały żel. Wyjmij grzebień.
Załaduj próbkę zmieszaną z barwnikiem wizualizacyjnym do studzienki i podłącz żel do źródła zasilania o żądanym napięciu. Mocznik zawarty w żelu umożliwia cząsteczkom RNA migrację jako gatunki liniowe.
Żel działa jak sito, umożliwiając ujemnie naładowanym cząsteczkom RNA przemieszczanie się przez pory w kierunku elektrody dodatniej. Podczas biegu ufosforylowany RNA, który jest z natury bardziej negatywny, porusza się szybciej niż niefosforylowany RNA.
Zobrazuj żel do wykrywania znakowanego fluorescencyjnie RNA. Obserwuj przesunięcie mobilności między szybciej migrującym fosforylowanym RNA, który pojawia się jako dolne pasmo w porównaniu z niefosforylowanym RNA.
Aby przygotować 15% denaturujący roztwór żelu akrylamidowego, połącz 22,5 mililitra wstępnie zmieszanego 40% roztworu akrylamidu/bis-akrylamidu 29:1, 6 mililitrów 10X TBE, 28,8 grama mocznika i wody wolnej od RNaz do całkowitej objętości 59 mililitrów. Następnie delikatnie wymieszaj roztwór.
Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej przez 20 sekund, zamieszaj i natychmiast włóż do kuchenki mikrofalowej na kolejne 20 sekund. Delikatnie mieszaj roztwór, aż mocznik całkowicie się rozpuści. Umieścić szklaną zlewkę w płytkiej łaźni wodnej zawierającej zimną wodę na 5 minut, upewniając się, że poziom zimnej wody otaczającej szklaną zlewkę jest wyższy niż poziom roztworu wewnątrz szklanej zlewki. Gdy roztwór ostygnie, przefiltruj go i odgazuj za pomocą jednorazowej jednostki filtrującej o średnicy 0,22 mikrometra, aby usunąć cząstki stałe i mikroskopijne pęcherzyki powietrza.
Umyj krótką i długą szklaną płytkę wodą z mydłem. Następnie spryskaj każdą płytkę 95% etanolem i wytrzyj szkło, aby usunąć wilgoć. Podnieś długi talerz z blatu, umieszczając go na pudełku. Następnie umieść 0,4-milimetrowe przekładki wzdłuż długich krawędzi płyty. Połóż krótką płytkę na długiej płycie, upewniając się, że krawędzie krótkiej płytki, długiej płyty i przekładek są wyrównane. Następnie zaciśnij z każdej strony trzema równomiernie rozmieszczonymi metalowymi zaciskami.
Dodaj 24 mikrolitry TEMED do roztworu akrylamidu i wymieszaj. Następnie dodaj 600 mikrolitrów 10% APS i natychmiast wlej roztwór między szklane płytki.
Wlanie roztworu akrylamidu między kanapkę ze szklaną płytą może być naprawdę trudne. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, postukaj w kanapkę ze szklanym talerzem podczas nalewania roztworu.
Ostrożnie dodaj czysty 32-dołkowy grzebień do górnej części kanapki ze szklaną płytą i pozwól akrylamidowi polimeryzować przez 30 minut.
Aby uruchomić żel, ustaw blok grzewczy na 75 stopni Celsjusza, zdejmij metalowe zaciski, a następnie dokładnie umyj i osusz kanapkę ze szklaną płytą. Umieść płytkę warstwową w aparacie żelowym z krótką płytką skierowaną do przodu i przygotuj bufor do pracy 0,5X TBE, łącząc 100 mililitrów 10X TBE z 1,9 litra wody wolnej od RNaz.
Dodać 600 mililitrów buforu do górnej i dolnej komory aparatu. Delikatnie wyjmij grzebień z żelu i dokładnie spłucz studzienki strzykawką. Uruchom żel z mocą 50 watów przez 30 minut. Następnie ponownie wypłucz studzienki.
Pulsacyjnie zakręć wygaszone reakcje i inkubuj je w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez 3 minuty. Powtórz wirowanie impulsowe i natychmiast załaduj 10 mikrolitrów każdej próbki na żel. Następnie uruchom żel na 3 godziny przy mocy 50 watów. Po zakończeniu pracy wyłącz zasilanie i opróżnij górną komorę aparatu.
Umyj i osusz zewnętrzną stronę kanapki ze szklaną płytą. Następnie przykryj go folią i przenieś do skanera laserowego w celu zobrazowania. Zamontuj kanapkę ze szklaną płytką na stoliku skanera laserowego, ustaw długości fal wzbudzenia i emisji dla żądanego fluoroforu i zobrazuj żel.