Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym częściowo denaturującym: technika rozdzielania polimorficznych włókien amyloidowych na podstawie niejednorodności wielkości

Włókna amyloidowe to agregaty nieprawidłowo sfałdowanych białek, które wykazują niejednorodność wielkości. Włókna te, będąc odporne na anionowe detergenty, takie jak SDS, mogą być analizowane za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym półdenaturującym.

Na początek weź wstępnie zmontowany, duży żel agarozowy o dużych porach, który zawiera SDS. Wysoka porowatość pozwala na oddzielenie nienaruszonych włókien podczas biegu. Na żel nałożyć bufor do biegania zawierający SDS.

Załaduj do żelu lizat komórkowy zawierający włókna amyloidowe. Obecność SDS i brak etapu podgrzewania próbki tworzy warunki półdenaturacji, w których detergent wiąże się z wysoce odpornymi amyloidami, nadając nienaruszonym włóknom równomierny ładunek ujemny.

Uruchom żel w pierwszym wymiarze przy odpowiednim napięciu. Pole elektryczne powoduje migrację ujemnie naładowanych amyloidów w kierunku dodatnio naładowanej anody.

Podczas biegu mniejsze włókna migrują szybko w porównaniu z większymi - tworząc rozmazany wzór pasma wskazujący na niejednorodność rozmiaru.

Po zakończeniu obróć żel prostopadle i uruchom go w drugim wymiarze. W tym wymiarze włókna poruszają się identycznie jak w pierwszym ciągu, rozdzielając się na podstawie ich rozmiarów. Tworzy to ukośny rozmaz, ponieważ mniejsze włókna migrują szybciej niż większe.

Powstanie ostrego pasma ukośnego potwierdza nienaruszoną, ale niejednorodną populację fibrylarów amyloidowych.

Aby przygotować żel, dodaj 2 gramy proszku agarozy do 200 mililitrów buforu TAE w szklanej zlewce. Następnie podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę.

Następnie dodaj 1 mililitr 20% SDS do końcowego stężenia 0,1%. Delikatnie zakręć zlewką.

Następnie wylej płynną agarozę na płytę żelową o wymiarach 15 cm x 14 cm. Aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, użyj pipety o pojemności 1 mililitra. Następnie umieść 20-dołkowy grzebień na żelu.

Następnie dodaj około 60 mikrogramów lizatu całokomórkowego w skrajnym prawym pasie żelu. Uruchom żel pod napięciem 60 V przez około cztery godziny, używając buforu TAE zawierającego 0,1% SDS, jako bufora bieżącego.

Aby uruchomić żel w drugim wymiarze, ostrożnie obróć żel o 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Następnie uruchom więzienie pod napięciem 60 woltów przez około cztery godziny.