Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym niebieskim: technika separacji bez denaturacji do analizy nienaruszonych kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Aby przeanalizować pięć kompleksów mitochondrialnych łańcucha oddechowego z nienaruszonymi podjednostkami, należy uzyskać kompleksy mitochondrialne rozpuszczone w łagodnym, niejonowym detergentzie. Wymieszać z buforem zawierającym Coomassie Blue-G, anionowy barwnik.

Coomassie zastępuje detergent i wiąże się niespecyficznie z kompleksami, nadając ładunek ujemny i barwiąc je na niebiesko. Dodatkowo Coomassie zapobiega agregacji kompleksów i pomaga zachować ich naturalną strukturę i funkcję.

W zbiorniku do elektroforezy zmontuj kasetę żelową składającą się z żelu o gradientowej rozdzielczości ze zmniejszającą się wielkością porów na całej długości, pokrytej żelem do układania w stosy o dużej wielkości porów. Napełnij komory anody i katody schłodzoną anodą i buforem katodowym zawierającym Coomassie.

Załaduj studzienki mieszaniną kompleksu białek związanych Coomassie. Zainicjuj elektroforezę.

Ujemnie naładowane kompleksy białkowe migrują z żelu układającego się w stos do żelu o rozdzielczości gradientowej, w kierunku dodatnio naładowanej anody. Podczas gdy mniejsze kompleksy szybko przechodzą przez pory, większe kompleksy są spowalniane przez ograniczone rozmiary porów, gdy przesuwają s