$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Aby przeanalizować pięć kompleksów mitochondrialnych łańcucha oddechowego z nienaruszonymi podjednostkami, należy uzyskać kompleksy mitochondrialne rozpuszczone w łagodnym, niejonowym detergentzie. Wymieszać z buforem zawierającym Coomassie Blue-G, anionowy barwnik.
Coomassie zastępuje detergent i wiąże się niespecyficznie z kompleksami, nadając ładunek ujemny i barwiąc je na niebiesko. Dodatkowo Coomassie zapobiega agregacji kompleksów i pomaga zachować ich naturalną strukturę i funkcję.
W zbiorniku do elektroforezy zmontuj kasetę żelową składającą się z żelu o gradientowej rozdzielczości ze zmniejszającą się wielkością porów na całej długości, pokrytej żelem do układania w stosy o dużej wielkości porów. Napełnij komory anody i katody schłodzoną anodą i buforem katodowym zawierającym Coomassie.
Załaduj studzienki mieszaniną kompleksu białek związanych Coomassie. Zainicjuj elektroforezę.
Ujemnie naładowane kompleksy białkowe migrują z żelu układającego się w stos do żelu o rozdzielczości gradientowej, w kierunku dodatnio naładowanej anody. Podczas gdy mniejsze kompleksy szybko przechodzą przez pory, większe kompleksy są spowalniane przez ograniczone rozmiary porów, gdy przesuwają się w dół żelu rozdzielczego.
Coomassie oddzielony od kompleksów podczas przebiegu jest zastępowany przez Coomassie w buforze katodowym, zapobiegając przesunięciu się kompleksów z ich odpowiednich pozycji w żelu. Po elektroforezie zwizualizuj żel. Kompleksy mitochondrialne pojawiają się jako niebieskie pasma rozdzielone w zależności od wielkości.
Kompleks II o najniższej masie cząsteczkowej zajmuje najniższą pozycję w żelu, a następnie kompleks IV, III i V. Kompleks I o najwyższej masie cząsteczkowej zajmuje najwyższą pozycję.
Aby wykonać elektroforezę z niebieskim natywnym żelem, najpierw dodaj bufor z niebieską katodą do kasety żelowej. Za pomocą pipety umyj i napełnij studzienki niebieskim buforem katodowym. Następnie załaduj od 5 do 30 mikrogramów próbek białka do studzienek. Delikatnie napełnij kasetę żelową do góry niebieskim buforem katodowym, a zbiornik buforem anodowym.
Najpierw uruchom żel przy stałym napięciu 40 woltów przez 15 minut. Następnie zwiększ napięcie do 80 woltów. Uruchom żel, aż barwnik osiągnie 2/3 długości żelu. Zastąp niebieski bufor katodowy buforem katodowym i kontynuuj elektroforezę, aż czoło barwnika spłynie z żelu.