Multimer-PAGE do separacji natywnych kompleksów białkowych: hybrydowa technika separacji składająca się z Blue native-PAGE i SDS-PAGE w celu oddzielenia nienaruszonych białek multimerycznych od lizatu tkankowego

Multimeryczne kompleksy białkowe są niezbędne w różnych procesach biologicznych.

Aby oddzielić kompleksy białkowe w ich stanie naturalnym za pomocą multimeru-PAGE, należy pobrać lizat tkankowy zawierający pożądane kompleksy. Załaduj lizat do zestawu żelowego dla Blue native PAGE.

Napełnij układ alkalicznym buforem zawierającym niebieski barwnik anionowy i podłącz go do zasilania. Przy zasadowym pH cząsteczki barwnika wiążą się z kompleksem białkowym, nadając mu ogólny ładunek ujemny bez denaturacji. Ten ujemnie naładowany, nienaruszony kompleks białkowy migruje przez żel jako niebieska wstęga.

Po minimalnym przebiegu i umożliwieniu migracji nienaruszonego białka do żelu rozdzielczego, należy wyciąć pasek zawierający kompleks. Inkubować pasek w roztworze zawierającym środek sieciujący, aby umożliwić jego reaktywnym grupom interakcję z grupami aminowymi białka proksymalnego, stabilizując kompleks multimeryczny.

Zastąp roztwór sieciujący odczynnikiem hartującym, aby osłabić aktywność nieprzereagowanych środków sieciujących. Dodaj SDS - anionowy detergent - który nadaje nienaruszony kompleks białkowy równomierny ładunek ujemny, zachowując jednocześnie ich naturalny rozmiar i skład.

Umieść leczony pasek w nowej kasecie i ponownie odlać go do nowego żelu SDS-PAGE. Podczas elektroforezy ujemnie naładowany usieciowany kompleks białkowy migruje w kierunku dodatniej anody i pojawia się jako pasmo o dużej masie cząsteczkowej w żelu.

Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj się do elektroforezy w niebieskim natywnym żelu poliakrylowamidowym, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podłącz elektrody do źródła zasilania i poddaj elektroforezie białka w żelu pod napięciem 150 woltów, aż pasmo barwnika wsunie się na około 2 centymetry w warstwę rozdzielczą. W tym momencie zatrzymaj się i odłącz zasilanie.

Po zdemontowaniu aparatu do elektroforezy należy oddzielić tafle szkła kasety żelowej. Usuń i wyrzuć warstwę układania.

Ostrożnie odetnij żel, tuż pod dolną krawędzią frontu barwnika, uważając, aby to cięcie było jak najbardziej gładkie i proste. Następnie wyrzuć niewykorzystany kawałek żelu. Odetnij wszelkie niewykorzystane części wzdłuż krawędzi paska żelu.

Ostrożnie umieść pasek w 10 mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w małym pojemniku i delikatnie mieszaj przez nutację przez 30 minut, aby zrównoważyć. Po zrównoważeniu wyrzuć i zastąp PBS kolejnymi 10 mililitrami.

Odpipetować 500 mikrolitrów 25-milimolowego DSP rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku do PBS i kontynuować mieszanie jak poprzednio przez 30 minut. Po 30 minutach odlej roztwór DSP. Dodaj 10 mililitrów 0,375 molowego Tris-HCl, pH 8,8, zawierającego 2% dodecylosiarczanu sodu, aby ugasić nieprzereagowany DSP. Kontynuuj nutację przez 15 minut.

Podczas hartowania paska żelu przygotuj roztwory żelu SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi metodami. Nie dodawać odczynników do polimeryzacji. Po schłodzeniu przywróć niebieski natywny pasek żelowy do temperatury pokojowej i wlej pasek do nowej kasety żelowej.

Aby to zrobić, ostrożnie podnieś żel i umieść go na czystej płytce dystansowej kasety żelowej. Ustaw pasek tak, aby był odwrócony z poprzedniej orientacji, a dolna część przodu barwnika znajdowała się najbliżej górnej części nowej kasety.

Umieść pasek tak, aby jego górna krawędź leżała równo z miejscem, w którym będzie znajdować się górna krawędź pokrywy. Upewnij się, że przód barwnika jest równoległy do poziomych krawędzi szklanej płytki. Dociśnij jedną stronę wyciętego paska do jednej ze ścianek przekładki, pozostawiając miejsce po drugiej stronie na wylanie żelu i załadowanie wzorca białkowego lub drabiny. Jeśli dolna krawędź paska żelowego zawiera jakiekolwiek postrzępione lub nierówne obszary, ostrożnie je odetnij.

Po prawidłowym umieszczeniu paska żelowego połóż płytkę osłonową na płycie dystansowej. Delikatnie dociśnij, aby wypchnąć uwięzione pęcherzyki powietrza. Kontynuuj montaż urządzenia do nalewania żelu, zgodnie z instrukcjami producenta.

Pasek żelu czasami przesuwa się podczas umieszczania górnej płyty. Pomocne jest, aby pasek nieco zwisał z krawędzi górnej płyty, dzięki czemu można go regulować szpatułką, aby skorygować wszelkie przesunięcia.

Dodać odczynniki polimeryzacyjne do rozdzielczego buforu żelowego i wlać go do przygotowanej kasety żelowej za pomocą pipety serologicznej. Napełnij kasetę z żelem do około 2 centymetrów poniżej wyciętego niebieskiego natywnego paska żelu PAGE, aby pozostawić miejsce na warstwę układania. Następnie dodaj 100 mikrolitrów butanolu na wierzch wlanego żelu i odczekaj 30 minut na polimeryzację warstwy rozdzielczej przed wylaniem butanolu.

Następnie dodaj odczynniki do polimeryzacji do roztworu żelu do układania w stosy. Za pomocą pipety serologicznej wlej warstwę ułożenia, aby wypełnić wszystkie pozostałe puste przestrzenie w kasecie z żelem. Przechyl kasetę z żelem podczas wylewania warstwy do układania w stos, aby wypełniła przestrzeń pod paskiem żelu i nie uwięziły pęcherzyków powietrza.

Gdy bufor żelu do układania w stos wypełni pustą przestrzeń pod paskiem żelu, stopniowo przywróć kasetę z żelem do poziomej podstawy. Kontynuuj wypełnianie pustej przestrzeni obok wyciętego paska żelu buforem żelu do układania w stos, aż prawie się przeleje. Następnie pozwól warstwie układania się polimeryzować przez 30 minut.

Po polimeryzacji warstwy układającej należy wyjąć kasetę z żelem z aparatu do nalewania, przepłukać ją wodą destylowaną i zmontować aparat do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta.

Całkowicie napełnij komorę wewnętrzną buforem działającym 1X SDS-PAGE. Następnie napełnij komorę zewnętrzną do poziomu wskazanego przez producenta. Załaduj przestrzeń obok wyciętego paska żelu za pomocą drabinki o masie cząsteczkowej lub odpowiedniego wzorca białka.

Podłącz elektrody do zasilania i poddaj próbki elektroforezie pod napięciem 120 woltów. Gdy barwnik Coomassie spłynie z żelu, przerwij bieg i odłącz zasilanie. Analizuj żel przy użyciu standardowych metod elektroblottingu i wykrywania białek na bazie przeciwciał.