JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:29 min • July 8th, 2025
Aby określić wielkość fragmentów DNA za pomocą elektroforezy kapilarnej, zacznij od pobrania wielodołkowej płytki testowej. Każda studzienka zawiera znakowane fluorescencyjnie, różnej wielkości amplikony PCR - dwuniciowe oligonukleotydy DNA uzyskane po cyklu PCR.
Dodaj do studzienki kilka dwuniciowych fragmentów DNA o różnej wielkości, które działają jak wzorzec wielkości. Każda z tych cząsteczek DNA zawiera znacznik fluorescencyjny dla łatwej identyfikacji.
Uzupełnij studnię formamidem, silnym denaturantem i podgrzej w wysokiej temperaturze. Ten etap denaturuje DNA, tworząc jednoniciowe fragmenty, które mogą łatwo migrować przez pory żelu.
Umieść płytkę w analizatorze fragmentów, który zawiera wstępnie wstrzyknięty żel polimerowy do swojego systemu kapilarnego.
Zastosuj wysokie napięcie, aby elektrokinetycznie wprowadzić DNA ze studni do kapilary o cienkiej średnicy na katodzie - ujemnym końcu. Ujemnie naładowane cząsteczki DNA migrują w kierunku dodatnio naładowanej anody. Krótsze nici DNA mają mniejszą siłę tarcia i poruszają się szybciej w żelu niż dłuższe nici DNA.
Podczas elektromigracji DNA przecina drogę wiązki laserowej, co powoduje fluoryzację barwnika. Sygnały emisyjne z barwnika są wychwytywane przez detektor, a następnie przekształcane w elektroferogram - wykres przedstawiający każde fluorescencyjne DNA jako różnokolorowy, indywidualny pik.
Porównaj nieznany pik fragmentu DNA z pikami odniesienia, aby przeanalizować jego rozmiar.
Po potwierdzeniu amplikonów PCR należy użyć nowych pasków lub płytek PCR, aby rozcieńczyć produkty PCR od 1 do 10 w oczyszczonej wodzie. Wirować i krótko odwirować. Podczas pracy w dygestorium należy przygotować mieszankę wzorcową w probówce wirówkowej składającej się z formamidu i roztworu wzorcowego o wielkości referencyjnej.
W zależności od liczby produktów PCR, które mają być analizowane, należy użyć objętości odczynników, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Pozwól na 10% nadwyżki objętości.
Krótko odwirować i rozprowadzić 9,5 mikrolitra do indywidualnych studzienek na płytce PCR, odpowiedniej dla dostępnego systemu elektroforezy kapilarnej. Następnie dodać 0,5 mikrolitra rozcieńczonego produktu PCR. Uszczelnić i krótko odwirować.
Następnie załaduj płytkę zawierającą próbki do termocyklera PCR i denaturuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 3 minuty, a następnie schładzaj do 4 stopni Celsjusza w nieskończoność. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę. Ostrożnie zdejmij uszczelkę i załaduj płytkę do skalibrowanego systemu elektroforezy kapilarnej zgodnie z instrukcjami producenta.
Przeprowadź analizę fragmentów elektroforezy kapilarnej przy użyciu odczynników odpowiednich dla wybranej aparatury i dostosuj warunki pracy zgodnie z opisem w manuskrypcie.