Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

W przypadku dwuwymiarowej elektroforezy żelowej mieszaniny białek pochodzących z homogenizowanej tkanki nowotworowej należy potraktować buforem zawierającym chaotropy, detergent obojczojonowy i środek redukujący. Chaotropy i detergenty denaturują i rozpuszczają białka. Czynniki redukujące redukują wiązania dwusiarczkowe białek, generując wolne grupy tiolowe i rozwijając białka w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości białek.

Przenieś poddaną działaniu mieszaniny białek do unieruchomionego gradientu pH, IPG, uchwytu paska. Umieścić pasek IPG zawierający liniowy gradient pH w matrycy żelu akrylowo-żelowego. Dodaj olej mineralny, aby zapobiec parowaniu roztworu białkowego. Przenieś uchwyt do izoelektrycznego systemu ogniskowania IEF. Poczekaj, aż roztwór białka ponownie nawodni pasek.

Wykonaj pierwszy wymiar IEF. Prąd elektryczny powoduje, że naładowane białka migrują przez gradient pH w kierunku przeciwnie naładowanych elektrod, unieruchamiając się w odpowiednich punktach izoelektrycznych - pH, przy którym białka mają zerowy ładunek netto.

Po IEF potraktuj pasek IPG dodecylosiarczanem sodu, SDS, anionowym detergentem, który nadaje białkom ładunek ujemny. Równoważyć ze środkiem alkilującym w celu modyfikacji białkowych grup tiolowych, zapewniając rozpuszczalność białek podczas elektroforezy.

Załaduj pasek na prefabrykowany żel rozdzielczy poliakryloamidu o małych porach i zabezpiecz stopioną agarozą. Napełnij komory buforem do elektroforezy zawierającym SDS. Zainicjuj elektroforezę drugiego wymiaru, prostopadle do IEF.

Ujemnie naładowane białka o większej masie cząsteczkowej przemieszczają się przez żel powoli w kierunku dodatnio naładowanej anody niż mniejsze białka, co ułatwia separację na podstawie wielkości.

Odplamić żel. Białka można uwidocznić jako dyskretne plamki na żelu.

Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 250 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu próbki białka do każdej szczeliny 13-centymetrowego uchwytu paska IPG. Umieść 18-centymetrowy pasek IPG, żelową stroną do dołu, na każdym roztworze próbki białka, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie dodaj 3 do 4 mililitrów oleju mineralnego, aby pokryć każdy pasek IPG.

Następnie zmontuj każdy uchwyt paska IPG w izoelektryczny system ustawiania ostrości, ze spiczastym końcem na tylnej płycie i kwadratowym końcem na przedniej płycie. Po ponownym nawodnieniu pasków IPG przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, ustaw parametry IEF w izoelektrycznym systemie ogniskowania z łącznym czasem pracy 7,5 godziny i 36,875 woltogodzin.

Po IEF wyjmij każdy pasek IPG z izoelektrycznego układu ogniskowania i usuń nadmiar oleju mineralnego nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym. Następnie zawiń każdy pasek w arkusz folii i przechowuj w temperaturze -80 stopni Celsjusza.

Aby odlać 12% żel PAGE, dodaj do zlewki podwójnie destylowaną wodę, 1,5-molowy bufor tris-solny, 40% roztwór podstawowy akrylamidu/bisakrylamidu, 10% nadsiarczanu amonu i TEMED. Delikatnie wymieszaj roztwór żelu, uważając, aby nie powstały bąbelki.

Delikatnie wlej roztwór żelu do komory wieloodlewniczej, do oczekiwanej wysokości żelu 19 centymetrów. Natychmiast dodaj około 3 mililitry podwójnie destylowanej wody do komory wieloodlewniczej, aby pokryć każdy żel rozdzielczy i pozwól każdemu żelowi polimeryzować przez około godzinę.

Ten krok jest bardzo ważny, aby przygotować wysokiej jakości żel SDS-PAGE. Na wierzch każdego żelu należy natychmiast dodać równą objętość wody.

Przygotuj dwa litry buforu do elektroforezy, a następnie dodaj bufor do zbiornika buforowego jednostki separacji elektroforezy.

Po wyjęciu skoncentrowanych pasków IPG z zamrażarki umieść je w plastikowym naczyniu zawierającym 1 mililitr redukującego buforu równowagi i śladową ilość błękitu bromofenolowego i równoważ je przez 10 minut delikatnym kołysaniem. Po usunięciu redukującego buforu równowagi dodaj 4 mililitry buforu równowagi alkilacyjnej i śladową ilość błękitu bromofenolowego do pasków IPG i równoważ je przez 10 minut delikatnym kołysaniem.

Podczas równowagi żelu należy zdemontować komorę odlewniczą i wyjąć przygotowaną kasetę z żelem rozdzielczym. Opłucz kasetę z żelem trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną, a następnie usuń nadmiar wody z kasety żelowej nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym i umieść ją w stojaku na żel.

Następnie spłucz zrównoważone paski IPG buforem do elektroforezy i usuń nadmiar płynu z każdej powierzchni paska IPG nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym. Umieść pasek IPG na rozdzielczym żelu SDS-PAGE, tak aby plastikowa strona paska IPG stykała się z dłuższą szklaną płytką, spiczastym końcem w lewo.

Teraz szybko dodaj 3 do 4 mililitrów gorącej 1% agarozy i buforu do elektroforezy SDS, aby uszczelnić pasek IPG na wierzchu każdego żelu SDS-PAGE i umieść górną stronę paska IPG na górze krótszej szklanej płytki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.

Te kroki są bardzo ważne, aby uszczelnić pasek IPG z żelem SDS-PAGE. Gorące roztwory agarozy należy natychmiast dodać, a pasek IPG należy natychmiast umieścić w górnej części żelu SDS.

Po polimeryzacji włóż zmontowaną kasetę żelową pionowo między plastikowe uszczelki a pionowy system elektroforezy. Umieść górną część żelu z paskiem IPG obok katody. Następnie należy wyregulować poziom bufora do elektroforezy, aby zanurzyć kasetę żelową poprzez dodanie odpowiedniej objętości buforu do systemu elektroforezy.

Podłącz i ustaw zasilacz w trybie stałego napięcia i pracuj pod napięciem 200 woltów przez około 370 minut, monitorując barwnik. Po zakończeniu biegu wyjmij kasetę z żelem z systemu elektroforezy i delikatnie wyjmij żel z kasety żelowej, uważając, aby nie rozerwać żelu.