Elektroforeza żelowa zymografii: technika elektroforetyczna do wykrywania metaloproteinaz macierzy poprzez ocenę aktywności enzymatycznej

Metaloproteinaza macierzy lub MMP, wielodomenowa proteaza składająca się z domen propeptydowych i katalitycznych, jest wydzielana jako nieaktywny enzym lub zymogen przez określone komórki. Interakcja między jonem w domenie katalitycznej a resztą cysteiny w domenie propeptydu utrzymuje MMP w stanie nieaktywnym.

Aby wykryć MMP w supernatancie hodowli komórkowej za pomocą elektroforezy żelowej zymografii, należy napełnić zbiornik do elektroforezy zawierający kasetę żelową dodecylosiarczanem sodu lub buforem biegowym zawierającym SDS.

Załadować supernatant hodowlany zmieszany z buforem ładującym, a następnie wzorce białkowe, do studzienek żelu poliakrylamidowego, skopolimeryzowanego z substratem białkowym specyficznym dla MMP.

SDS, ujemnie naładowany detergent, w warunkach nieredukcyjnych zakłóca interakcje cysteina-w MMP i denaturuje białka, jednocześnie nadając ładunek ujemny.

Wykonaj elektroforezę. Pole elektryczne powoduje, że ujemnie naładowane białka migrują w kierunku dodatnio naładowanej anody, powodując separację białek na podstawie wielkości.

Po elektroforezie potraktuj żel niejonowym buforem do renaturyzacji zawierającym detergent. Niejonowe detergenty zastępują SDS, renatur