Elektroforeza żelowa zymografii: technika elektroforetyczna do wykrywania metaloproteinaz macierzy poprzez ocenę aktywności enzymatycznej

Metaloproteinaza macierzy lub MMP, wielodomenowa proteaza składająca się z domen propeptydowych i katalitycznych, jest wydzielana jako nieaktywny enzym lub zymogen przez określone komórki. Interakcja między jonem w domenie katalitycznej a resztą cysteiny w domenie propeptydu utrzymuje MMP w stanie nieaktywnym.

Aby wykryć MMP w supernatancie hodowli komórkowej za pomocą elektroforezy żelowej zymografii, należy napełnić zbiornik do elektroforezy zawierający kasetę żelową dodecylosiarczanem sodu lub buforem biegowym zawierającym SDS.

Załadować supernatant hodowlany zmieszany z buforem ładującym, a następnie wzorce białkowe, do studzienek żelu poliakrylamidowego, skopolimeryzowanego z substratem białkowym specyficznym dla MMP.

SDS, ujemnie naładowany detergent, w warunkach nieredukcyjnych zakłóca interakcje cysteina-w MMP i denaturuje białka, jednocześnie nadając ładunek ujemny.

Wykonaj elektroforezę. Pole elektryczne powoduje, że ujemnie naładowane białka migrują w kierunku dodatnio naładowanej anody, powodując separację białek na podstawie wielkości.

Po elektroforezie potraktuj żel niejonowym buforem do renaturyzacji zawierającym detergent. Niejonowe detergenty zastępują SDS, renaturyzując białka i częściowo przywracając aktywność MMP. MMP są dalej przetwarzane do stanu w pełni aktywnego.

Inkubować w rozwijającym się buforze zawierającym kationy metali dwuwartościowych niezbędne do aktywności MMP. Aktywne MMP wraz z kationami trawią substrat MMP w żelu. Umyj żel, aby usunąć strawione produkty. Odplamić żel.

Obszary aktywności MMP, pozbawione substratu MMP, pojawiają się jako wyraźne pasma na ciemnoniebieskim tle niestrawionego substratu. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania intensywność opaski żelowej może być skorelowana z aktywnością MMP.

Przed rozpoczęciem tego protokołu należy przygotować wszystkie metaloproteinazy macierzy lub MMP odpowiednio do utrzymania funkcji enzymów. Próbki mogą być używane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80 stopni Celsjusza. W tym przypadku MMP-2, znany również jako żelatynaza A lub kolagenaza typu IV, służy do demonstracji wizualizacji aktywności MMP za pomocą zymografii.

Po przygotowaniu enzymów MMP należy zaopatrzyć się w 10% żelową saszetkę z żelem zymogramowym zawierającą żel umieszczony w kasecie. Wypłucz kasetę wodą dejonizowaną. Usuń taśmę ochronną z dolnej części kasety, a grzebień z górnej części żelu. Przepłukać studzienki trzykrotnie buforem do biegania Tris-Glycine SDS.

Umieść żel w aparacie do elektroforezy mini-ogniw, upewniając się, że mniejsza strona kasety jest skierowana do wewnątrz. Zablokuj żel na miejscu za pomocą klina napinającego żel. Napełnij górną komorę aparatu buforem do pracy Tris-Glycine SDS powyżej poziomu studzienek i sprawdź, czy nie ma wycieków. Napełnij również dolną komorę zestawu do elektroforezy żelowej buforem do pracy.

Następnie załaduj 10 mikrolitrów markera molekularnego białka.

Zmieszać równą ilość próbki z buforem wypełniającym żel, który nie zawiera środków redukujących. W przeciwieństwie do zwykłego SDS-PAGE, nie gotuj próbek, a zamiast tego załaduj je bezpośrednio do dołków żelu, używając końcówek do ładowania żelu. Studnie te mogą pomieścić do 20 mikrolitrów objętości.

Umieść pokrywę na mini-ogniwie i podłącz przewody elektrod do zasilania. Włącz zasilanie i ustaw żel tak, aby działał na stałym poziomie 125 woltów przez 90 minut. Sprawdź tworzenie się małych pęcherzyków na drucie dolnej komory, wskazujących na cyrkulację prądu.

Podczas uruchamiania pierwszego żelu należy monitorować postęp migracji co 15 minut, używając jako wskaźnika błękitu bromofenolowego zawartego w buforze ładującym. Dla każdego żelu przygotuj 100 mililitrów buforu do renaturyzacji zymogramu 1X i 200 mililitrów buforu rozwijającego zymogram, oba w wodzie dejonizowanej.

Gdy niebieski barwnik tropiący bromofenol dotrze do dna żelu, wyłącz zasilanie.

Otwórz mini-komórkę i usuń żel. Oddziel dwie strony kasety za pomocą noża do żelu. Wytnij róg, aby zaznaczyć kierunek żelu. Ostrożnie wyjmij żel z kasety i umieść go w pojemniku ze 100 mililitrami buforu do renaturyzacji.

Inkubować żel przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

Usunąć bufor do renaturyzacji i dodać 100 mililitrów buforu rozwijającego się do żelu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

Następnie usuń bufor rozwijający i dodaj do żelu dodatkowe 100 mililitrów świeżego buforu rozwijającego się. Inkubuj żel przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po całonocnej inkubacji usunąć rozwijający się bufor i przemyć żel, inkubując go z wodą dejonizowaną, pod delikatnym mieszaniem, przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz to pranie dwa razy.

Umieść żel na plastikowym ochraniaczu na arkusz i usuń bąbelki. Następnie zeskanuj żel za pomocą fotoskanera, aby zapisać dokładne położenie standardowych pasm białkowych, ponieważ po zabarwieniu żelem staną się one ledwo widoczne.

Zabarwić żel, dodając do żelu 20 mililitrów SimplyBlue SafeStain. Inkubować żel przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, pod delikatnym mieszaniem.

Usuń SimplyBlue SafeBale i odplam żel w 100 mililitrach dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.

Po 1 godzinie zastąp świeżą wodą dejonizowaną i kontynuuj inkubację żelu przez co najmniej godzinę.