Trójkomorowy test impedancji oparty na układzie: technika analizy w czasie rzeczywistym do oceny potencjału inwazyjnego komórek rakowych poprzez pomiar impedancji elektrycznej

Komórki zrębowe związane z rakiem wydzielają czynniki chemiczne, które mogą wyzwalać przerzutowe komórki nowotworowe znajdujące się na błonie podstawnej tkanki. W konsekwencji komórki rakowe atakują błonę podstawną i migrują w kierunku przestrzeni zewnątrzkomórkowej tkanki.

Aby zmierzyć zdolność inwazyjną komórek rakowych in vitro, zacznij od płytki wielodołkowej z wieloma trójkomorowymi układami. W każdej macierzy dolna komora ma przylegającą hodowlę komórek zrębu. Górna komora z mikroelektrodami mierzącymi impedancję ze stopioną stopionką - miniaturowymi elektrodami, które mierzą aktywność elektryczną komórki - jest pokryta komórkami rakowymi, które przylegają do mikroporowatej błony pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową znajdującą się nad elektrodami.

Podczas inkubacji na analizatorze opartym na impedancji komórki zrębu uwalniają do pożywki czynniki chemotaktyczne, które przemieszczają się w kierunku komórek rakowych. Czynniki te przemieszczają się przez półprzepuszczalną membranę znajdującą się w dolnej części środkowej komory.

Czynniki wydzielane przez komórki zrębu sygnalizują przylegającym komórkom nowotworowym przekształcenie się w inwazyjne fenotypy. W odpowiedzi komórki inwazyjne migrują przez mikroporowatą błonę, docierając do elektrod międzypalcowych po przeciwnej stronie membrany.

Z biegiem czasu, gdy więcej komórek rakowych przykleja się do elektrod, powodują impedancję komórkową - utrudniają przepływ prądu przez komórki. Pomiar impedancji komórkowej wskazuje na potencjał inwazyjny komórek nowotworowych.

Umieść wszystkie trzy sterylne komory w kapturze do hodowli tkankowych. Zlokalizuj pokrętło na krótszym boku dolnej komory i ustaw dolną komorę tak, aby pokrętło było skierowane w stronę eksperymentatora.

Dodaj od 30 000 do 50 000 komórek w 90 mikrolitrach pożywki do każdej studzienki z dolnej komory, nie tworząc żadnych pęcherzyków. Użyć 5% pożywki uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą w dwóch dolnych komorach jako pozytywną kontrolę ruchliwości komórek i użyć 0% pożywki uzupełnionej surowicą jako kontroli negatywnej.

Obróć dolną komorę o 90 stopni po pozostawieniu jej na 10 do 15 minut w okapie. Następnie umieść środkową komorę na górze, tak aby pokrętło na dolnej komorze wsunęło się w wycięcie w środkowej komorze. Popchnij komorę pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.

Dodaj 160 mikrolitrów pożywki bez surowicy do wszystkich studzienek środkowej komory. Upewnij się, że menisk w kształcie kopuły jest widoczny po napełnieniu studzienek i umieść górną komorę, z elektrodami skierowanymi w dół, na środkową komorę, aby wyrównać niebieskie kropki na środkowej i górnej komorze. Dociśnij komorę pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.

Dodaj od 20 do 50 mikrolitrów pożywki bez surowicy do górnej komory. Zamontuj zestaw na dwufunkcyjnym analizatorze komórek w inkubatorze do hodowli tkankowych i odczekaj 30 minut przed pomiarem tła.

Otwórz oprogramowanie analizatora komórek, a następnie wybierz podstawkę, która ma być używana, a następnie kliknij zakładkę "Wiadomość" i upewnij się, że jest na niej napisane "Połączenia OK", aby upewnić się, że matryca jest dobrze umieszczona w podstawce, a elektrody są dobrze wyrównane z czujnikami.

Kliknij zakładkę "Notatki z eksperymentu" i uzupełnij wszystkie możliwe informacje o eksperymencie. Następnie kliknij w zakładkę "Układ" i uzupełnij opis układu tablicy. Następnie kliknij zakładkę "Harmonogram" i dodaj dwa kroki z menu "Kroki"; Krok tła z jednym zamiataniem i krok testowy z 100 przebiegami.

Po 30 minutach przebywania matrycy w inkubatorze z dwufunkcyjnym analizatorem komórek, kliknij przycisk "Odtwórz", aby rozpocząć pomiar tła.

Po wykonaniu pomiaru tła wyjmij matrycę z kołyski i umieść ją z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych. Następnie dodaj od 30 000 do 50 000 komórek w 100 mikrolitrach pożywki bez surowicy do każdej studzienki górnej komory. Są to komórki, które elektroda wykryje, gdy pomyślnie przejdą przez membranę.

Pozostaw zespół w okapie na 30 minut przed zamontowaniem na dwufunkcyjnym analizatorze ogniw do pomiaru impedancji.

Umieść tablicę z powrotem w analizatorze komórek o podwójnym przeznaczeniu i sprawdź zakładkę "Wiadomość" dla komunikatu "Połączenia OK". Kliknij przycisk "Odtwórz", aby rozpocząć pomiar impedancji, a następnie kliknij zakładkę "Wykres", aby monitorować postęp sygnału.

Jeśli punkt końcowy zostanie osiągnięty przed upływem 25 godzin, kliknij krok "Przerwij" w menu rozwijanym "Wykonaj". Aby wyeksportować dane, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy, wybierz "Kopiuj" w formacie listy, a następnie wklej dane do arkusza kalkulacyjnego.