Pomiar skurczu SMC in vitro: nieinwazyjna metoda oceny skurczu komórek mięśni gładkich za pomocą wykrywania impedancji elektrycznego podłoża ogniwa

Ściana aorty składa się głównie z komórek mięśni gładkich lub SMC, zawierających kurczliwą maszynerię białkową, która kurczy się i rozluźnia, aby regulować przepływ krwi w aorcie.

Aby zmierzyć odpowiedź skurczową aortalnych SMC in vitro, należy uzyskać płytkę wielodołkową zawierającą matrycę czujników ECIS (ang. electrical cell-substrate impedancing impedancing). Każda tablica zawiera elektrody ze złotą folią na dnie studni, wyznaczone folią izolacyjną. Posmaruj dołki żelatyną.

Wysiewaj pierwotną ludzką zawiesinę SMC do studni. Przenieść płytkę studzienkową zawierającą ECIS do uchwytu płytki podłączonej do wzmacniacza i systemu akwizycji danych, zapewniając jednocześnie kontakt elektrody z uchwytem. Zastosuj mały stały prąd przemienny między elektrodami, aby zmierzyć potencjał na nich.

Podczas inkubacji SMC przylegają i rozprowadzają się na otoczce żelatynowej. Ogniwa zachowują się jak izolatory, ograniczając przepływ prądu między elektrodami. W miarę jak więcej komórek przyczepia się do powierzchni, przepływ prądu jeszcze bardziej się zmniejsza. W rezultacie wzrasta impedancja, czyli opozycja do przepływu prądu, i potencjał. W końcu ogniwa namnażają się na elektrodach i tworzą monowarstwę.

Potraktuj SMC jonoforem wapnia, aby ułatwić transport jonów wapnia przez błony komórkowe. Zewnątrzkomórkowy napływ jonów wapnia aktywuje aparat skurczowy, wywołując skurcz.

Stymulowane SMC kurczą się i tracą kontakt komórka-komórka na elektrodach. Wynikające z tego zmniejszenie pokrycia powierzchni elektrody zmniejsza impedancję, ułatwiając ilościową ocenę skurczu SMC w czasie rzeczywistym.

Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i wysiewaj SMC w trzech egzemplarzach przy gęstości wysiewu 30 000 komórek na studzienkę, w 200 mikrolitrach pożywki SMC na pokrytej żelatyną płytce ECIS. Umieścić płytkę z SMC w uchwycie ECIS 96-dołkowym w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Kliknij dwukrotnie "Oprogramowanie ECIS Applied Biophysics", aby otworzyć program, a następnie naciśnij przycisk "Setup". Sprawdź, czy wszystkie elektrody stykają się z uchwytem, w lewym dolnym panelu oznaczonym "Konfiguracja studni". Jeśli elektrody nie są prawidłowo podłączone, wyreguluj płytkę w uchwycie przed rozpoczęciem pomiaru.

Teraz wybierz typ płyty w tym samym panelu, klikając "Typ tablicy". Następnie przygotuj dwie pipety o objętości 2 mikrolitrów i 150 mikrolitrów. Przed rozpoczęciem stymulacji naciśnij "Znak" w oprogramowaniu i umieść komentarz.

Aby pobudzić komórki, zdejmij pokrywę i umieść ją na sterylnej powierzchni wewnątrz inkubatora. Następnie wywołaj skurcz SMC, pipetując 2 mikrolitry roztworu roboczego jonomycyny do każdego dołka tak szybko, jak to możliwe.

Po stymulacji wszystkich komórek wymieszać pożywkę w studzienkach za pomocą drugiej pipety.