Test ślizgowych włókien aktynowych: test ruchliwości in vitro w celu zbadania translokacji włókien aktynowych na unieruchomione miozyny

Miozyna - białko motoryczne - oddziałuje z innym białkiem nitkowatym, aktyną, powodując jego translokację.

Aby przeanalizować ruch poślizgowy aktyny, zmontuj szklaną komorę przepływową opartą na szkiełku tak, aby wewnętrzna część górnej części komory była pokryta nitrocelulozą. Przepływają białka miozyny przez komorę, które unieruchamiają się nad powłoką nitrocelulozową.

Uzupełnij komorę nieznakowanymi włóknami aktynowymi - czarnymi aktynami - i dodaj bufor ruchliwości zawierający trifosforan adenozyny lub cząsteczki ATP.

Filamenty aktynowe wiążą się z unieruchomionymi aktywnymi miozynami wraz z nieaktywnymi lub martwymi miozynami. Cząsteczki ATP oddziałują z aktywnymi miozynami, prowadząc do ich dysocjacji od czarnych aktyn, podczas gdy nieaktywne miozyny pozostają związane aktyną.

Wirówka do granulowania nieaktywnych miozyn przyłączonych do czarnych aktyn. Dokładnie spłucz buforem, aby usunąć nieaktywne osady miozyny, wolne włókna aktyny i niewykorzystane ATP. Przepływ w znakowanych fluorescencyjnie aktynach, które wiążą unieruchomione, aktywne miozyny.

Uzupełnić komorę o bufor końcowy zawierający czynnik spulchniający - metylocelulozę oraz ATP. Czynnik spieniający zmusza filamen