Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:36 min. • July 8th, 2025
Lucyferazy to enzym, który utlenia swój substrat, tworząc produkt bioluminescencyjny.
Ta właściwość lucyferazy jest pomocna w projektowaniu systemu reporterowego opartego na nanolucyferazie, w którym używana jest podzielona wersja enzymu. W tym systemie mniejsze i większe fragmenty mają wysokie powinowactwo wiązania względem siebie i mogą odtworzyć funkcjonalny enzym.
Aby wykorzystać system oparty na nanolucyferazie do wykrywania białka docelowego - domeny wiążącej receptor glikoproteiny kolca SARS-CoV-2 - należy rozpocząć od naczynia hodowlanego zawierającego przylegające komórki. Komórki te zawierają plazmid kodujący białko docelowe w połączeniu z sekwencją specyficzną dla mniejszego fragmentu zmodyfikowanej nanolucyferazy.
Po ekspresji hodowane komórki wytwarzają bioreportery - rekombinowane białka docelowe połączone z mniejszym fragmentem lucyferazy. Potraktuj komórki buforem do lizy i inkubuj pod mieszaniem. Składniki buforowe szybko poddają się lizie komórek - uwalniając zawartość komórkową, w tym bioreportery, do supernatantu.
Przenieść supernatant na płytkę do badania wielodołkowego. Uzupełnij każdą studzienkę roztworem zawierającym duże fragmenty rozszczepionej nanolucyfer
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych