Test ekstrakcji Msp1 w celu zbadania usuwania błędnie zlokalizowanych białek TA

Msp1, ATPaza w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, usuwa nieprawidłowo zlokalizowane białka zakotwiczone w ogonie lub TA z błony przez jej heksameryczne centralne pory, ułatwiając ich degradację.

Aby zrozumieć mechanizm translokacji, należy odtworzyć białka TA i Msp1 w liposomach, umożliwiając ich integrację z dwuwarstwą lipidową.

Przygotować mieszaninę reakcyjną, dodając odtworzone liposomy do odpowiedniego buforu zawierającego białka opiekuńcze — cytozolowe białka kontroli jakości. Białka opiekuńcze są oznaczone s-transferazą glutationu lub enzymem GST.

Dodaj trifosforan adenozyny — ATP — do reakcji. Msp1 wiąże się z cząsteczkami ATP i hydrolizuje je. Wykorzystując energię generowaną przez hydrolizę, Msp1 przemieszcza białka TA związane z błoną przez swój centralny por. Białka opiekuńcze w mieszaninie reakcyjnej wiążą się z domeną transbłonową wyekstrahowanych białek TA.

Następnie załaduj mieszaninę reakcyjną do kolumny oczyszczającej powinowactwo. Kolumna zawiera żywicę sprzężoną ze zredukowanym glutationem lub GSH. Białko GST na białkach opiekuńczych wiąże się ze sprzężonym GSH - jego substratem - przyłączając kompleksy białkowe białka opiekuńczego-TA do żywicy.

Zakręć kolumną