Test zwapnienia do pomiaru stężenia wapnia w komórkach śródmiąższowych zastawki aortalnej

Płatki zastawki aortalnej zawierają niejednorodną populację komórek śródmiąższowych zastawki lub VICs, rozmieszczonych w warstwach macierzy zewnątrzkomórkowej. Po stymulacji VIC przekształcają się w osteoblasty ― komórki tworzące macierz kostną.

Dojrzałe osteoblasty wydzielają kolagen i białka macierzy kostnej. Białka te pomagają osteoblastom przyczepiać się do macierzy. Wreszcie wewnątrzkomórkowe jony wapnia dostają się do środowiska macierzy i wraz z fosforanami osadzają się w postaci zmineralizowanych guzków, co prowadzi do zwapnienia zastawki aortalnej.

Aby ocenić stężenie wapnia w zwapniałych zastawkach aortalnych, należy rozpocząć od hodowli VIC na płytce sześciodołkowej. Wyrzuć pożywkę hodowlaną, dodaj pożywkę osteogenną do studzienki i inkubuj.

Podczas inkubacji insulina w pożywce osteogennej stymuluje VIC do różnicowania się w fenotypy osteogenne. Te osteoblasty wydzielają białka macierzy kostnej i kwas askorbinowy w środowisku osteogennym, co indukuje je do tworzenia bogatej w kolagen macierzy zewnątrzkomórkowej.

Wreszcie, wewnątrzkomórkowy wapń osteoblastów i fosforany pożywki tworzą zmineralizowane kryształy w pożywce.

Usuń pożywkę i dodaj roztwór kwasu solnego. Inkubować w celu rozpuszczenia jonów wapnia w roztworze. Dozować kwaśne podłoże zawierające wapń do dołka płytki wielodołkowej.

Dodaj barwnik wrażliwy na wapń i inkubuj. Cząsteczki barwnika wiążą się z jonami wapnia w środowisku kwaśnym, tworząc fioletowy kompleks barwnikowo-wapniowy.

Zmierzyć absorbancję kompleksu, która jest proporcjonalna do stężenia wapnia w próbce.

Przed rozpoczęciem testu wyczyść kaptur bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i podgrzej podłoże DMEM do 37 stopni Celsjusza. Następnie wysiewaj 100 000 komórek na warunki na 6-dołkowe płytki w kompletnym DMEM i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 24 godzinach zastąp pożywkę sklarowaną pożywką wapniącą i inkubuj komórki przez 7 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wymieniając pożywkę trzeciego dnia.

Po 7 dniach zmierz stężenie wapnia w 96-dołkowej płytce za pomocą odczynnika Arsenazo III i zapisz absorbancję na 650 nanometrach.