$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
W oku ssaków naczyniówka, znajdująca się między twardówką a siatkówką, zawiera makrofagi okołonaczyniowe i naczyniówkę włosowatą - warstwę naczyń włosowatych krwi wyłożoną perycytami, która dostarcza tlen i składniki odżywcze do siatkówki. Nieprawidłowe naczynie krwionośne wyrastające z naczyniówki występuje w wielu naczyniowych chorobach oczu.
Aby zbadać rozregulowaną naczyniówkę włosowatą kiełkującą ex vivo, weź zebrane eksplantaty oczu myszy zawierające naczyniówkę przyczepioną do twardówki i nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE.
Dodaj kropelki ekstraktu z błony podstawowej lub BME - hydrożelu wzbogaconego w białka macierzy zewnątrzkomórkowej - do studzienek płytki wielodołkowej. Umieść eksplantaty w kropli, unikając spłaszczania tkanek. Pozwól, aby BME zestalił się.
Dodać pożywkę uzupełnioną komórkami śródbłonka lub czynnikami wzrostu specyficznymi dla EC. Inkubować. RPE wydziela czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych, który wraz z czynnikami wzrostu specyficznymi dla EC stymuluje proliferację EC naczyń włosowatych.
Zestalony BME tworzy macierz zewnątrzkomórkową, która sprzyja proliferacji EC do tworzenia kiełkujących kanalików kapilarnych. Perycyty migrują i przyczepiają się do tych kiełkujących naczyń włosowatych, ułatwiając dojrzewanie naczyń włosowatych EC.
Aktywowane makrofagi w regionie kiełkowania wydzielają enzymy do trawienia błony Brucha - najbardziej wewnętrznej warstwy naczyniówki - która umożliwia kiełkom migrację do RPE.
Pod mikroskopem uwidocznij kiełkujące naczynia włosowate. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania zmierz obszar pokryty kiełkiem naczyniówki.
Większy obszar kiełkowania naczyniówki wskazuje na postępujące kiełkowanie naczyniówkowo-naczyniówki w eksplantacie.
Dodaj 30 mikrolitrów rozmrożonego BME do środka każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że kropla BME tworzy wypukłą kopułę na dnie płytki, nie dotykając krawędzi.
Umieść tkankę na środku BME. Nie spłaszczaj eksplantatu naczyniówki. Pozwól tkance rozszerzyć się w obrębie BME. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby żel stężał. Następnie dodaj 500 mikrolitrów kompletnego klasycznego podłoża do każdej studzienki. Zmieniaj klasyczne podłoże co drugi dzień.
Kiełkowanie naczyniówki można zaobserwować po trzech dniach pod mikroskopem. Otwórz obraz kiełkowania naczyniówki za pomocą obrazu J i zaznacz "Obraz | Rodzaj | i 8-bitowy" ze skalą szarości. Następnie zoptymalizuj kontrast, wybierając "Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast" i dostosowując go.
Użyj funkcji "Magiczna różdżka", aby obrysować i usunąć tkankę naczyniówki, która znajduje się w środku kiełków. Usuń tło obrazu za pomocą bezpłatnych narzędzi do zaznaczania.
Następnie przejdź do "Obraz | Dostosuj | Próg " i użyj funkcji "Próg", aby zdefiniować kiełki mikronaczyniowe na tle i na obrzeżach. Kliknij "F2", a pojawi się podsumowanie. Kliknij "Zapisz", aby zapisać obraz wybranego obszaru w tym samym folderze, co oryginalny obraz, do wykorzystania w przyszłości.
Po zmierzeniu grupy próbek skopiuj zarejestrowane dane do analizy.