Czasowo-rozdzielczy transfer energii rezonansu Forstera do monitorowania fosforylacji białek w komórkach
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:13 min. • July 8th, 2025
Fosforylacja niektórych białek komórkowych jest kluczowym mechanizmem regulacyjnym, który prowadzi do ich aktywacji lub dezaktywacji.
Aby monitorować specyficzną fosforylację białek, należy pobrać płytkę hodowlaną zawierającą przylegające komórki. Potraktuj komórki stymulatorem, aby promować fosforylację białek w komórkach. Odessać zużytą pożywkę i dodać bufor do lizy komórek oraz koktajl inhibitorów fosfatazy.
Składniki buforowe powodują lizę komórek, uwalniając zawartość komórkową wraz z fosforylowanymi i niefosforylowanymi białkami. Koktajl inhibitorów inaktywuje fosfatazę komórkową, dzięki czemu fosforylowane białka pozostają nienaruszone.
Przenieść lizat komórkowy na płytkę detekcyjną o małej objętości. Potraktuj lizat przeciwciałami dawcy i akceptora przyłączonymi do różnych światłoczułych fluoroforów.
Podczas inkubacji przeciwciała dawcy rozpoznają specyficzny epitop na białku testowym, co pozwala im związać ufosforylowane i niefosforylowane warianty białka. W przeciwieństwie do tego, przeciwciała akceptorowe wiążą się wyłącznie z ufosforylowaną formą badanego białka.
To wiązanie zbliża fluorofor akceptorowy do fluoroforu donorowego w fosforylowanych wariantach białka. Ta bl
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych