Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej do wykrywania mutacji indel w genach docelowych

Cyfrowy kropelkowy PCR wykrywa mutacje indel — losową insercję lub delecję nukleotydów w DNA. Osiąga się to poprzez podzielenie próbki na maleńkie kropelki i niezależną amplifikację DNA w każdej kropli.

Aby wykonać ddPCR, należy pobrać próbkę DNA zawierającą dzikie i zmutowane warianty genu docelowego. Załadować mieszaninę próbek i olej do oddzielnych przegródek komory generatora kropel zawierającej kanał mikroprzepływowy.

Próbka i olej szybko przepływają przez wąskie kanały, emulgują na skrzyżowaniu i są dzielone na kilka kropel, z których każda zawiera kilka cząsteczek DNA.

Teraz weź płytkę PCR z buforem zawierającym startery do przodu i do tyłu, dNTP, termostabilną polimerazę DNA i dwie sondy oznaczone różnymi fluoroforami i cząsteczkami wygaszającymi. Każda sonda jest specyficzna dla określonego typu allelu — dzikiego lub zmutowanego.

Przenieś kropelki na płytkę PCR. Umieść płytkę w termocyklerze i uruchom reakcję. Podczas denaturacji nici DNA rozdzielają się. W temperaturze wyżarzania startery i sondy wyżarzają się do matrycy DNA.

Sonda z zielonymi i pomarańczowymi fluoroforami wiąże się odpowiednio z sekwencją DNA typu dzikiego i zmutowanego. Później polimeraza DNA wydłuża st