JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:30 min. • July 8th, 2025
Gradientowa reakcja łańcuchowa polimerazy to technika optymalizacji temperatury wyżarzania, w której startery - specyficzne dla sekwencji, jednoniciowe DNA - wiążą się z komplementarnymi miejscami na matrycowym DNA.
Weź mieszaninę zawierającą startery do przodu i do tyłu, dNTP i termostabilną polimerazę DNA w odpowiednim buforze. Dodać matrycę DNA i przenieść składniki na płytkę PCR.
Umieść płytkę w gradientowym termocyklerze ze specjalistycznym blokiem grzewczym. W ten sposób powstaje liniowy gradient temperatury wyżarzania w zakresie od 55 °C do 65 °C, ze stałym wzrostem temperatury na całej płycie.
Reakcja podgrzewa płytkę w wysokiej temperaturze, denaturując dwuniciowe DNA na pojedyncze nici i aktywując polimerazę DNA. Później temperatura jest obniżana zgodnie z zaprogramowanymi wartościami w każdym dołku, co ułatwia wyżarzanie gruntu.
W temperaturze wyżarzania poniżej optymalnej startery wiążą się niespecyficznie ze zdenaturowanym DNA, co prowadzi do niespecyficznej amplifikacji podczas reakcji PCR. W temperaturze powyżej optymalnej niewystarczająca ilość starterów wiąże się z DNA.
W optymalnej temperaturze startery wiążą się specyficznie z docelowym DNA. Następnie temperatura
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych