JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 8:45 min. • July 8th, 2025
Duplex cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy — ddPCR — umożliwia jednoczesne ilościowe wykrywanie dwóch odrębnych markerów genetycznych.
Aby rozpocząć, weź próbkę zawierającą dwie różne sekwencje docelowe. Dodaj mieszaninę zawierającą termostabilny enzym polimerazę DNA, dNTP i startery specyficzne dla celu. Następnie dodaj dwie różne sondy oligonukleotydowe specyficzne dla celu, oznaczone reporterami fluorescencyjnymi i cząsteczką wygaszającą w celu wykrycia amplifikowanych celów.
Roztwór emulguje się olejem w celu podzielenia docelowych sekwencji na liczne nanokropelki. Każda kropla zawierająca cel działa jak indywidualne naczynie reakcyjne.
Rozpocznij proces cykli termicznych dla reakcji amplifikacji wewnątrz pojedynczych nanokropel.
W wysokiej temperaturze denaturacji dwuniciowe tarcze rozdzielają się na pojedyncze nici.
Obniż temperaturę, aby osiągnąć odpowiednią temperaturę wyżarzania, umożliwiając starterom i sondom oligonukleotydowym związanie się z matrycą.
Bliskość wygaszacza tłumi fluorescencję reportera. W temperaturze rozciągnięcia polimeraza DNA rozciąga startery i rozszczepia sondę oligonukleotydową. Niezwiązany reporter emituje fluorescencję.
Przepuść kropelki przez
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych