Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Duplex cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy — ddPCR — umożliwia jednoczesne ilościowe wykrywanie dwóch odrębnych markerów genetycznych.

Aby rozpocząć, weź próbkę zawierającą dwie różne sekwencje docelowe. Dodaj mieszaninę zawierającą termostabilny enzym polimerazę DNA, dNTP i startery specyficzne dla celu. Następnie dodaj dwie różne sondy oligonukleotydowe specyficzne dla celu, oznaczone reporterami fluorescencyjnymi i cząsteczką wygaszającą w celu wykrycia amplifikowanych celów.

Roztwór emulguje się olejem w celu podzielenia docelowych sekwencji na liczne nanokropelki. Każda kropla zawierająca cel działa jak indywidualne naczynie reakcyjne.

Rozpocznij proces cykli termicznych dla reakcji amplifikacji wewnątrz pojedynczych nanokropel.

W wysokiej temperaturze denaturacji dwuniciowe tarcze rozdzielają się na pojedyncze nici.

Obniż temperaturę, aby osiągnąć odpowiednią temperaturę wyżarzania, umożliwiając starterom i sondom oligonukleotydowym związanie się z matrycą.

Bliskość wygaszacza tłumi fluorescencję reportera. W temperaturze rozciągnięcia polimeraza DNA rozciąga startery i rozszczepia sondę oligonukleotydową. Niezwiązany reporter emituje fluorescencję.

Przepuść kropelki przez czytnik kropel — system wykrywania fluorescencji. Detekcja pojedynczej lub podwójnej fluorescencji wskazuje na dodatnie kropelki zawierające cele, podczas gdy brak sygnału wskazuje na ujemne krople.

Stosunek dodatnich kropel do całkowitej liczby partycji określa początkowe stężenie sekwencji docelowych.

Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw przygotuj 100 mikromoli na litr stężeń podstawowych dla wszystkich starterów w wodzie molekularnej i sond w buforze TE pH 8, jak opisano w tekście protokołu. Następnie przygotuj mieszankę główną, mieszając odpowiednie ilości cyfrowej mieszanki PCR, starterów do przodu i do tyłu, sondy fluorescencyjnej i wody wolnej od nukleaz. Pipetować w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby wymieszać, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu.

Ponieważ mieszanka główna dPCR jest bardziej lepka niż konwencjonalna mieszanka wzorcowa qPCR, konieczne jest użycie techniki mieszania przez pipetowanie w celu uzyskania jednorodnego roztworu. Pozwala to na dokładną kwantyfikację dPCR na dalszych etapach.

Aby przygotować mieszaninę testową do wytwarzania kropelek do badania próbek w dwóch egzemplarzach, należy odpipetować 36 mikrolitrów mieszanki wzorcowej na zwykłą płytkę PCR. Do każdej z 36-mikrolitrowych mieszanek wzorcowych wymieszać 12 mikrolitrów matrycy DNA, pozostawiając odpowiednie studzienki replikacji puste na płytce. Uwzględnij kontrole pozytywne, aby upewnić się, że test przebiega prawidłowo. Nie dołączaj żadnych kontrolek szablonowych ani NTC, aby upewnić się, że na płytce nie ma zanieczyszczeń, i aby później ustawić fluorescencyjną linię bazową do analizy danych.

Przed skonfigurowaniem generatora kropel należy wymieszać mieszaniny testowe za pomocą pipety wielokanałowej, aby pipetować mieszaniny w górę i w dół około 15 razy. Upewnij się, że końcówka pipety pozostaje w cieczy, aby uniknąć tworzenia się nadmiaru pęcherzyków w mieszaninie.

Następnie włóż pierwszy wkład, zawierający osiem dołków, do białego uchwytu na wkład i zatrzasnąć uchwyt wkładu. Pierwszy nabój jest teraz mocno osadzony i nie można go wysunąć z uchwytu podczas generowania kropel.

Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie przenieść 20 mikrolitrów mieszaniny testowej do środkowej pozycji wkładu oznaczonej "Próbka" bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Odpipetować 70 mikrolitrów oleju wytwarzającego kropelki po lewej stronie wkładu oznaczonego "Olej".

Przykryj wkład uszczelką, upewniając się, że uszczelka jest płaska i równomiernie trzymana przez cztery znaczniki w kierunku krawędzi wkładu. Naciśnij podświetlony na zielono przycisk na generatorze kropel, aby otworzyć drzwiczki i umieścić wkład. Naciśnij przycisk ponownie, aby zamknąć generator. Po zamknięciu drzwi zielony przycisk jest przyciemniony i nie można ich ponownie otworzyć.

Wytwarzanie kropelek rozpocznie się natychmiast i będzie trwało przez około 1 minutę.

Podczas wytwarzania kropli należy umieścić drugi wkład w drugim białym uchwycie na wkład i przygotować go w taki sam sposób, jak w przypadku pierwszego wkładu. Po zakończeniu generowania kropel słabo podświetlony przycisk zmieni kolor na zielony.

Otwórz drzwiczki generatora kropel. Wyjmij biały uchwyt na wkład zawierający wkład pierwszy i odłóż go na bok. Umieść drugi wkład w generatorze kropel.

Usuń uszczelkę z pierwszego wkładu i wyrzuć. Nie odklikuj białego uchwytu na wkład, ponieważ może to spowodować przerwanie nowo wygenerowanych kropel.

Używając pipety wielokanałowej ustawionej na 40 mikrolitrów, włóż końcówki do trzeciej kolumny kropelek oznaczonych wkładem pod kątem 45 stopni i powoli odpipetuj wszystkie kropelki. Przenieś je na ostateczną płytkę do PCR, przykładając końcówkę pipety do ścianki studzienki mniej więcej do połowy i powoli usuwając kroplę.

W ten sam sposób, gdy wytwarzanie kropel dla drugiego wkładu zostanie zakończone, usuń uszczelkę z drugiego wkładu i przenieś wytworzone kropelki na końcową płytkę PCR. Umieść przebijaną osłonę foliową na wierzchu płytki i umieść ją na zgrzewarce do płyt. Ustaw uszczelniacz na 180 stopni Celsjusza. Naciśnij "Play" na zgrzewarce i uszczelnij na 10 sekund.

Aby rozpocząć tę procedurę, umieść szczelną końcową płytkę PCR w termocyklerze. Użyj termocyklera, który jest kompatybilny z końcową płytką PCR i ma prędkość narastania temperatury 2 stopnie Celsjusza na sekundę.

Uruchom następujący program termiczny: 10 minut w 95 stopniach Celsjusza, a następnie 40 cykli po 30 sekund w temperaturze 94 stopni Celsjusza i 60 sekund w temperaturze 60 stopni Celsjusza, a następnie 10-minutowe zatrzymanie w temperaturze 98 stopni Celsjusza. Po zakończeniu cyklu przenieś płytkę do czytnika kropelek w celu automatycznego pomiaru fluorescencji w każdej kropli w każdym dołku.

Upewnij się, że kropelki mają temperaturę pokojową przed przystąpieniem do odczytu kropel. Zacznij od otwarcia dołączonego oprogramowania, aby skonfigurować odczyt kropelki. W domyślnym menu "Ustawienia" zawierającym schemat pustej płytki 96-dołkowej, kliknij dwukrotnie na studzienkę A1, aby otworzyć menu zawierające trzy sekcje - "Próbka", "Test 1" i "Test 2".

W sekcji przykładu wpisz identyfikator próbki w polu oznaczonym "Nazwa" i zaznacz pole po prawej stronie oznaczone jako "Zastosuj". Następnie kliknij menu rozwijane oznaczone "Eksperyment". Wybierz "CZERWONY" dla wykrywania rzadkich zdarzeń i kliknij "Enter".

Przejdź do sekcji oznaczonej jako "A1". W sekcji "Nazwa" wypełnij test i kliknij "Enter". W polu poniżej oznaczonym "Typ" kliknij menu rozwijane, wybierz "Kanał 1 nieznany" i kliknij "Enter".

Przejdź do sekcji oznaczonej jako "A2". W sekcji "Nazwa" wypełnij test i kliknij "Enter". W polu poniżej oznaczonym "Typ" kliknij menu rozwijane, wybierz "Kanał 2 nieznany" i kliknij "Enter".

Wszystkie informacje z poprzednich kroków są teraz obecne w studni A1.

Nazwij wszystkie kolejne studzienki zawierające kropelki. Aby zaoszczędzić całkowity czas konfiguracji, kliknij "Shift" lub "Control", aby wybrać wiele dołków jednocześnie. Gdy cyfrowy obraz tablicy odzwierciedla fizyczną tabliczkę, naciśnij "OK" w prawym dolnym rogu menu. W nowym menu, które pojawi się w górnej części schematu płyty, w sekcji "Szablon" wybierz "Zapisz jako" oraz nazwę i zapisz płytę.

Po lewej stronie ekranu kliknij "Uruchom" i wybierz odpowiedni zestaw barwników w wyskakującym oknie "Opcje uruchamiania". Zbieranie danych rozpocznie się i jest wyświetlane w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu.