JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:08 min. • July 8th, 2025
Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym jest przydatny do identyfikacji infekcji wirusowych.
Rozpocznij od próbki zawierającej docelowe wirusowe RNA. Dodaj startery specyficzne dla celu - wspomagające zarówno syntezę, jak i amplifikację DNA - wraz z enzymem odwrotnej transkryptazy i dNTP.
Dodaj termostabilną polimerazę DNA - enzym do amplifikacji DNA w cyklach PCR - i SYBR green - barwnik, który interkaluje się w dwuniciowy DNA, dsDNA. Umieść reakcję w termocyklerze. Ustaw odpowiednią temperaturę, aby startery związały się z docelowym RNA.
Odwrotna transkryptaza dodaje dNTP do startera, jednocześnie rozszczepiając matrycę RNA, syntetyzując cDNA.
Zwiększ temperaturę, dezaktywując odwrotną transkryptazę. Obniż temperaturę, pozwalając starterom na wyżarzanie się do cDNA w celu późniejszej amplifikacji. Zwiększ temperaturę, aby osiągnąć etap wydłużania, w którym polimeraza DNA rozciąga startery, syntetyzując dsDNA.
Kolejne cykle skutkują wykładniczą amplifikacją dsDNA. SYBR zielony wiąże się z DNA w coraz większej liczbie, powodując proporcjonalny wzrost emisji fluorescencji. Wykreśl sygnał fluorescencyjny wykryty w różnych cyklach.
Dodatnia krzywa amplifikacji wska
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych