JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:25 min. • July 8th, 2025
Aby zliczyć bakteriofagi za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy, qPCR, należy otrzymać koktajl reakcyjny qPCR zawierający polimerazę DNA Taq, startery, trifosforany deoksynukleotydowe - dNTP - i fluorescencyjne cząsteczki barwnika reporterowego w zoptymalizowanym buforze. Przenieść do dołków płytki qPCR.
Dodaj bakteriofagi poddane obróbce cieplnej. Obróbka cieplna uwalnia DNA bakteriofaga z cząstek bakteriofagów. Uszczelnij płytę, zapobiegając parowaniu mieszaniny. Załaduj płytkę do systemu qPCR, ustawiając odpowiednie warunki cykliczne.
Ogrzewanie do wysokich temperatur denaturuje dwuniciowe DNA na pojedyncze nici. Aktywuje również polimerazę DNA Taq. Wyżarzanie powoduje, że startery specyficzne dla sekwencji wiążą się z komplementarnymi niciami DNA bakteriofagów. Rozszerzenie umożliwia aktywowanej polimerazie DNA Taq dodanie dNTP do końca 3' startera, przedłużając rosnącą nić DNA w kierunku od 5' do 3'.
Cząsteczki barwnika interkalują w nowo zsyntetyzowanym dwuniciowym DNA, powodując zwiększoną intensywność fluorescencji. Każdy cykl PCR podwaja docelową ilość DNA, zwiększając intensywność fluorescencji.
Określ cykl progowy, wartość Ct, przy której mierzona fluorescencja przekracza poziom tła.
Wartość Ct jest odwrotnie proporcjonalna do wyjściowej ilości DNA, przy czym każdy genom bakteriofaga jest równoważny jednej cząstce bakteriofaga, co ułatwia kwantyfikację bakteriofagów na podstawie krzywej wzorcowej DNA bakteriofaga.
Po amplifikacji przeprowadzić analizę krzywej topnienia, stopniowo zwiększając temperaturę reakcji. W określonej temperaturze topnienia połowa DNA rozdziela się na pojedyncze nici, uwalniając cząsteczki barwnika i powodując nagły spadek fluorescencji.
Wyraźna temperatura topnienia, unikalna dla produktu qPCR, potwierdza specyfikę produktu.
Przygotować premiks qPCR dla 10 biopanowanych próbek fagów o nieznanym stężeniu i 7 próbek o standardowych stężeniach w trzech egzemplarzach, co daje premiks dla 51 próbek zawierających 255 mikrolitrów qPCR Master Mix, 51 mikrolitrów starterów i 102 mikrolitry wody.
Podwielokrotność 8 mikrolitrów przygotowanego PCR wymieszać do 51 dołków 96-dołkowej płytki qPCR. Następnie dodaj dwa mikrolitry poddanych obróbce cieplnej próbek fagów T7 do każdej z tych studzienek, dozując je pod powierzchnię premiksu qPCR. Za pomocą folii samoprzylepnej uszczelnij płytkę.
Owiń płytkę folią aluminiową, aby zminimalizować fotowybielanie fluorescencyjne, a następnie przystąp do uruchamiania płytki na sprzęcie qPCR. Ustaw warunki cykliczne i ustawienia krzywej topnienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym.