Dlaczego metoda microsphere-PCR usprawnia walidację celu?

Metoda Microsphere-PCR pozwala na otrzymanie czystego jednoniciowego DNA poprzez oddzielenie amplifikowanych nici sensownych od dwuniciowych zanieczyszczeń, co redukuje liczbę fałszywych sygnałów w testach hybrydyzacyjnych stosowanych w badaniach zaangażowania celu.

W jaki sposób asymetryczna amplifikacja w metodzie microsphere-PCR wspomaga identyfikację leadów?

Metoda ta wykorzystuje znakowane primery do preferencyjnej syntezy nici sensy, co umożliwia otrzymanie wolnego od zanieczyszczeń jednoniciowego DNA, poprawiającego wiarygodność testów podczas screeningu związków wiodących.

Jakie pomiary ilościowe umożliwia metoda microsphere-PCR w ocenie przedklinicznej?

Metoda Microsphere-PCR pozwala na uzyskanie mierzalnych amplikonów jednoniciowego DNA, które nadają się do kwantyfikacji za pomocą elektroforezy żelowej, co umożliwia spójny pomiar zmian w ekspresji genów w modelach chorób.

Dlaczego wymogi dotyczące powtarzalności są istotne dla metody microsphere-PCR w ramach współpracy międzyfunkcyjnej?

Powtarzalne zbieranie supernatantu po amplifikacji zapewnia stałą wydajność jednoniciowego DNA, co umożliwia niezawodną wymianę danych pomiędzy zespołami ds. odkryć, rozwoju testów oraz zespołami przedklinicznymi.Jakiej analizy statystycznej wymagane jest przeprowadzenie przed wdrożeniem metody microsphere-PCR w procesie odkrywania (discovery pipeline)?

Jakiej analizy statystycznej wymagane jest przeprowadzenie przed wdrożeniem metody microsphere-PCR w procesie odkrywania (discovery pipeline)?

Wdrożenie wymaga walidacji wydajności amplifikacji oraz czystości produktu poprzez eksperymenty powtórzone, wraz ze statystycznym porównaniem prążków jednoniciowego i dwuniciowego DNA w celu potwierdzenia swoistości.

Reakcja łańcuchowa polimerazy mikrosferycznej w celu amplifikacji jednoniciowego DNA

JoVE Encyclopedia of Experiments

Techniki biologiczne

0 wyświetleń • 3:02 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microsphere-PCR wykorzystuje mikrokulę sprzężoną z oligonukleotydami na ich powierzchni, co umożliwia preferencyjną amplifikację jednoniciowego DNA.

Aby rozpocząć mikrosferyczny PCR, weź mieszaninę reakcyjną zawierającą matrycowe jednoniciowe nici DNA, startery do przodu z dodatkowym znacznikiem nukleotydowym, termostabilną polimerazę DNA, dNTP i mikrosfery wyświetlające jednoniciowe sondy oligonukleotydowe.

Umieść probówkę w termocyklerze i pracuj w określonych warunkach.

W pierwszym cyklu, w temperaturze wyżarzania, matryca DNA wiąże się z sondą na powierzchni mikrosfery w taki sposób, że matryca DNA działa jako nić wyczuwalna. Podczas rozciągania polimeraza wydłuża DNA, a dupleks pozostaje przyłączony do mikrosfery.

W następnym cyklu, podczas denaturacji, matrycowy DNA oddziela się od mikrosfery, pozostawiając nić sondy związaną z powierzchnią - służącą jako matryca dla nowej nici.

Podczas wyżarzania oznaczony podkład wiąże się z pasmem antysensownym. Później polimeraza wydłuża go, aby zsyntetyzować nić sensacyjną ze znacznikiem nukleotydu.

Powtórz cykl kilka razy, aby wygenerować wiele kopii jednoniciowego DNA, które trafiają do roztworu, podczas gdy dwuniciowe zanieczyszczenia pozostają przyłączone.

Przenieść produkty PCR do probówki zawierającej bufor ładujący. Załaduj produkt i markery do różnych dołków żelu i oddziel za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Matrycowe DNA tworzą słabe pasmo o niskiej masie cząsteczkowej, podczas gdy intensywne pasmo o wysokiej masie cząsteczkowej potwierdza amplifikację jednoniciowego DNA.

Uzyskaj około 25 mikrosfer poprzez zliczanie mikroskopowe za pomocą mikroskopu świetlnego o 40-krotnym powiększeniu. Następnie połącz wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij asymetryczny PCR w odpowiednich warunkach.

Pobranie supernatantu po symetrycznym PCR jest jednym z najbardziej krytycznych etapów, ponieważ jest to główny proces generowania jednoniciowego DNA z mikrosferami.

Po amplifikacji dodaj osiem mikrolitrów bufora ładującego 6X do każdej próbki. Załaduj 15 mikrolitrów każdej próbki do 2% żelu agarozowego. Następnie wykonuj elektroforezę przy napięciu 100 woltów przez 35 minut w buforze 1X TAE.