Nested-PCR w celu wykrycia określonej sekwencji genomowej wirusa
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:20 min. • July 8th, 2025
Zagnieżdżona reakcja łańcuchowa polimerazy, zagnieżdżony PCR, może selektywnie amplifikować określone sekwencje genów.
Aby wykryć docelową sekwencję wirusa, należy rozpocząć od mieszanki głównej zawierającej zewnętrzne startery komplementarne do większego regionu DNA zawierającego docelową sekwencję wirusa, dNTP i termostabilną polimerazę DNA w odpowiednim buforze.
Dodaj do tej mieszanki dwuniciowe wirusowe DNA, wyekstrahowane z komórek zakażonych wirusem. Przenieś probówkę do termocyklera; przeprowadzić pierwszy cykl PCR.
Podczas denaturacji dwuniciowe DNA wytwarza dwie jednoniciowe matryce. W odpowiedniej temperaturze wyżarzania zewnętrzne startery wiążą się z odpowiadającymi im sekwencjami docelowymi. Później polimeraza DNA wydłuża startery za pomocą dNTP, wytwarzając duże amplikony, zawierające określoną sekwencję w amplifikowanym DNA.
Przenieś te amplikony do nowej lampy. Uzupełnij świeżą mieszanką wzorcową zawierającą wewnętrzne lub zagnieżdżone startery ukierunkowane na mniejszą, bardziej specyficzną sekwencję w obrębie większego amplifikowanego DNA. Uruchom drugi PCR.
Podczas drugiego PCR nić DNA ulega denaturacji. Po denaturacji zagnieżdżone startery wiążą miejsca docelowe
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych