JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:09 min. • July 8th, 2025
Reakcja łańcuchowa polimerazy topniejącej o wysokiej rozdzielczości, HRM-PCR, wykrywa dwuniciowe DNA, zmiany sekwencji dsDNA z dużą precyzją.
Rozpocząć od mieszaniny wzorcowej zawierającej nieaktywną polimerazę Taq, trifosforany dezoksyrybonukleotydowe - dNTP - i fluorescencyjny barwnik reporterowy. Dodaj startery do przodu i do tyłu. Odpipetować mieszaninę do dołków płytki PCR.
Dodaj szablon dsDNA. Uszczelnij płytę, zapobiegając parowaniu mieszaniny. Rozpocznij PCR.
Wysoka temperatura denaturacji denaturuje dsDNA do jednoniciowego DNA, ssDNA, i aktywuje polimerazę. Reakcja jest następnie schładzana do temperatury wyżarzania, ułatwiając wiązanie starterów do przodu i do tyłu z ssDNA poprzez specyficzne dla miejsca komplementarne parowanie zasad.
Aktywowana polimeraza zostaje zrekrutowana, rozszerzając dupleks startera DNA poprzez dodanie dNTP.
Fluorescencyjny barwnik reporterowy - barwnik specyficzny dla dsDNA obecny w stężeniach nasycających - interkaluje się w całym dupleksie, fluoryzując jasno. Duplex przechodzi wiele cykli PCR, wytwarzając kilka fragmentów zawierających warianty.
Po PCR przeprowadź analizę krzywej topnienia, stale zwiększając temperaturę reakcji w czasie.
W zal
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych