Reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej Multiplex w celu wykrycia metylacji DNA w leukocytach

Metylacja reszty cytozyny DNA jest cechą charakterystyczną leukocytów lub białych krwinek.

Reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej (mdPCR) umożliwia jednoczesną identyfikację wielu regionów metylowanego DNA w leukocytach.

Przygotuj mieszaninę zawierającą bufor reakcyjny, polimerazę DNA i wodę wolną od nukleaz. Dodaj startery do przodu i do tyłu oraz sondy hydrolizy fluorescencyjnej specyficzne dla każdego regionu docelowego. Sondy składają się z różnokolorowych reporterów fluoroforowych połączonych z wygaszaczami w celu zahamowania emisji fluorescencji.

Dodaj DNA przekształcone w wodorosiarczyn, w którym niemetylowane cytozyny są deaminowane do uracyli, podczas gdy metylowane cytozyny pozostają niezmienione. Mieszać.

Napełnij szklaną strzykawkę mieszaniną oleju nośnikowego i środka powierzchniowo czynnego, a drugą mieszanką oleju nośnikowego i PCR i podłącz je do generatora kropel mikroprzepływowych. Mieszanina oleju nośnikowego i wodnego PCR emulguje do kropelek o wielkości poniżej nanolitrów. Surfaktant stabilizuje emulsję i zapobiega łączeniu się kropel.

Zbierz kropelki i wykonaj PCR. W każdej kropelce wysoka temperatura denaturacji denaturuje dwuniciowy DNA na jednoniciowy DNA i aktywuje polimerazę. Temperatura reakcji jest obniżona, co pozwala na wyżarzanie starterów i sond w zależności od miejsca.

Gdy polimeraza wiąże i wydłuża dupleks startera DNA, uracyle amplifikują się jako tyminy, podczas gdy metylowane cytozyny amplifikują się jako cytozyny, co pozwala na rozróżnienie regionów metylowanych i niemetylowanych. Polimeraza dalej rozszczepia i uwalnia reporter z sondy, powodując emisję fluorescencji.

Po PCR zwizualizuj krople pod mikroskopem. Kolor fluorescencji wskazuje na obecność określonych celów metylowanego DNA.

W celu wytworzenia kropelek zmieszać 1 mikrolitr DNA przekształconego w wodorosiarczyn ze świeżo przygotowaną mieszanką główną sondy w probówce do PCR i zebrać próbkę przez krótkie odwirowanie. Użyj złączek PEEK, aby podłączyć jednorazowe rurki płynowe do dwóch precyzyjnych szklanych strzykawek o objętości 250 mikrolitrów i wstępnie napełnij jedną precyzyjną szklaną strzykawkę 250 mikrolitrami oleju nośnikowego zawierającego 5% fluoro-surfaktantu i jedną precyzyjną szklaną strzykawkę 50 mikrolitrami oleju nośnikowego.

Po załadowaniu obu strzykawek załaduj 100 mikrolitrów mieszanki PCR do strzykawki z olejem nośnikowym i umieść kropelkowe urządzenie mikroprzepływowe na stoliku pionowego mikroskopu świetlnego wyposażonego w szybką kamerę.

W celu obserwacji i rejestracji tworzenia się kropel w czasie rzeczywistym, należy umieścić wstępnie napełnione strzykawki na programowalnej pompie strzykawkowej i użyć złączki PEEK ze złączkami do połączenia rurki strzykawek z rurkami odpowiednich kanałów wlotowych urządzenia mikroprzepływowego kropelkowego.

Umieść rurkę od wylotu generatora kropel do wnętrza 0,5-mililitrowej probówki do PCR i dostosuj natężenie przepływu pompy strzykawkowej do 2 mikrolitrów na minutę. Poczekaj, aż wielkość kropli ustabilizuje się przed zebraniem powstałej emulsji. Powoli i ostrożnie zbierz emulsję z górnej części probówki i przenieś 75 mikrolitrów roztworu do 200-mikrolitrowej probówki do PCR w celu przeprowadzenia cykli termicznych.

Następnie upewnij się, że zawartość oleju w probówce PCR ściśle odpowiada objętości fazy rozproszonej, aby zapobiec koalescencji kropelek podczas cykli termicznych, i umieść probówkę o pojemności 200 mikrolitrów w termocyklerze.