Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Ilościowy western blotting - technika oparta na normalizacji białka całkowitego - jest przydatna do ilościowego określania docelowych poziomów ekspresji białka.

Na początek załaduj lizat tkankowy do studzienek żelu gradientowego z poliakrylamidu. Lizat zawiera białko docelowe wraz z innymi białkami komórkowymi.

Uruchomić żel pod odpowiednim napięciem w celu elektroforetycznego rozdzielenia białek próbki wzdłuż gradientu. Po zakończeniu umieść żel na membranie polimerowej stosu transferowego.

Zastosuj prąd elektryczny, aby przenieść oddzielone białka na błonę. Następnie umieść membranę w fluorescencyjnym barwieniu białka całkowitego. Naładowane cząsteczki barwnika w barwieniu wiążą się elektrostatycznie ze wszystkimi białkami na błonie.

Dodaj rozwiązanie blokujące. W ten sposób białka w roztworze wiążą się z błoną. zapobieganie niespecyficznemu wiązaniu odczynników wykrywających. Dodaj pierwszorzędowe przeciwciało wiążące się tylko z białkiem docelowym. Następnie dodaj przeciwciało drugorzędowe - znakowane fluoroforem - które przyłącza się do przeciwciała pierwszorzędowego.

Wzbudzić próbkę za pomocą lasera. Zarejestrować emitowaną fluorescencję z cząsteczek barwnika całkowitego barw