Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Ilościowy western blotting - technika oparta na normalizacji białka całkowitego - jest przydatna do ilościowego określania docelowych poziomów ekspresji białka.

Na początek załaduj lizat tkankowy do studzienek żelu gradientowego z poliakrylamidu. Lizat zawiera białko docelowe wraz z innymi białkami komórkowymi.

Uruchomić żel pod odpowiednim napięciem w celu elektroforetycznego rozdzielenia białek próbki wzdłuż gradientu. Po zakończeniu umieść żel na membranie polimerowej stosu transferowego.

Zastosuj prąd elektryczny, aby przenieść oddzielone białka na błonę. Następnie umieść membranę w fluorescencyjnym barwieniu białka całkowitego. Naładowane cząsteczki barwnika w barwieniu wiążą się elektrostatycznie ze wszystkimi białkami na błonie.

Dodaj rozwiązanie blokujące. W ten sposób białka w roztworze wiążą się z błoną. zapobieganie niespecyficznemu wiązaniu odczynników wykrywających. Dodaj pierwszorzędowe przeciwciało wiążące się tylko z białkiem docelowym. Następnie dodaj przeciwciało drugorzędowe - znakowane fluoroforem - które przyłącza się do przeciwciała pierwszorzędowego.

Wzbudzić próbkę za pomocą lasera. Zarejestrować emitowaną fluorescencję z cząsteczek barwnika całkowitego barwienia białka i fluoroforów związanych z przeciwciałami na odpowiednich długościach fal.

Aby obliczyć znormalizowaną wartość obciążenia białka, podziel całkowity sygnał białkowy każdego pasma przez najwyższą wartość. Podziel sygnał białka docelowego przez odpowiednią znormalizowaną wartość obciążenia, aby określić względną ekspresję białka docelowego.

Do elektroforezy należy ustawić wstępnie obsadzony żel gradientowy Bis-Tris o stężeniu od 4 do 12% w systemie komory do elektroforezy żelowej i załadować do studzienki 3,5 mikrolitra wzorca białkowego. W przypadku stosowania wzorca wewnętrznego do normalizacji między błonami, załaduj ilość równą innym próbkom do pierwszych trzech dołków obok drabinki białkowej i załaduj 30 mikrogramów każdej próbki do pozostałych dołków. Następnie przepuść próbki przez żel do układania w stos pod napięciem 80 V przez 10 minut, a następnie 150 V przez dodatkowe 45 do 60 minut.

Pod koniec elektroforezy, aby zmontować stos transferowy, umieść żel białkowy na dolnym stosie zawierającym membranę z polifluorku winylidenu, a następnie na bibule filtracyjnej. Użyj wałka do bibuły, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i umieść górny stos na wierzchu bibuły filtracyjnej, a następnie ponownie zwiń stos, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Przenieś cały stos do urządzenia transferowego z elektrodą po lewej stronie urządzenia i umieść gąbkę żelową na wierzchu stosu, tak aby gąbka była wyrównana z odpowiednimi stykami elektrycznymi na urządzeniu.

Po zamknięciu pokrywy wybierz i uruchom odpowiedni program. Pod koniec programu przytnij membranę do rozmiaru żelu i szybko umyj przeciętą membranę wodą podwójnie destylowaną, a następnie kontynuuj barwienie całkowitym białkiem.

Aby uzyskać całkowite barwienie białka, zwiń membranę do 50-mililitrowej probówki stroną z białkiem skierowaną do wewnątrz i oznacz membranę 5 mililitrami roztworu barwienia białkowego na wałku przez 5 minut w temperaturze pokojowej w dygestoriach.

Pod koniec inkubacji szybko przemyć membranę 5 mililitrami roztworu myjącego, zwracając rurkę na krótko do wałka między praniami, a następnie krótko spłukać ultraczystą wodą. Dodaj 3 milimetry buforu blokującego do membrany i zwróć membranę do rolki na 30 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp bufor blokujący pierwotnym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania o odpowiednim zoptymalizowanym stężeniu i inkubuj membranę na walcu przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnego dnia umyj membranę 6 razy przez 5 minut 5 mililitrami świeżego PBS na pranie na wałku w temperaturze pokojowej. Po ostatnim praniu inkubować membranę z odpowiednim roztworem przeciwciał wtórnych na wałku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie 3 płukania przez 30 minut na pranie. Po ostatnim praniu wysusz membranę i użyj folii aluminiowej, aby chronić membranę przed światłem.

W celu uzyskania obrazu umieść membranę na skanerze stroną z białkiem skierowaną w dół i wybierz obszar skanowania w oprogramowaniu. Następnie pobierz obrazy w obu kanałach i wyeksportuj je do odpowiedniego programu do analizy obrazów.

Wyświetl kanał 700-nanometrowy, aby pokazać całkowity wynik barwienia białka, a następnie wybierz "Analiza" i narysuj prostokąt, aby zdefiniować obszar zainteresowania do normalizacji. Następnie skopiuj i wklej pierwszy obszar prostokąta do każdej pojedynczej próbki, aby upewnić się, że zdefiniowany obszar ma ten sam rozmiar dla wszystkich analizowanych pasów.

Aby określić ilościowo stężenie białka na każdym pasie, skopiuj wyniki zarówno całkowitego barwienia białka, jak i białka będącego przedmiotem zainteresowania do programu arkusza kalkulacyjnego i określ najwyższy sygnał całkowitego barwienia białka. Następnie podziel każdą całkowitą wartość sygnału barwienia białka przez tę wartość, aby uzyskać znormalizowaną wartość obciążenia białka, i podziel wartość sygnału 800-nanometrowej z każdej pojedynczej próbki przez odpowiadającą jej znormalizowaną wartość białka, aby obliczyć względny współczynnik ekspresji białka w różnych próbkach.