Northern Blot do wykrywania i ilościowego oznaczania specyficznego mikroRNA w całkowitym ekstrakcie RNA tkanki roślinnej

MikroRNA, miRNA, to małe, jednoniciowe, niekodujące RNA. miRNA włączają się do kompleksu wielobiałkowego i dalej wiążą się z komplementarnymi docelowymi sekwencjami mRNA, aby negatywnie regulować ekspresję genów.

Aby wykryć specyficzne miRNA z całkowitego RNA z tkanek roślinnych, dodaj barwnik ładujący żel zawierający barwniki śledzące i formamid - środek denaturujący RNA. Podgrzej próbkę, aby zdenaturować RNA i zapobiec tworzeniu się struktury drugorzędowej przed elektroforezą.

Załaduj próbkę i standardowe markery RNA do studzienek wstępnie zmontowanego denaturującego żelu poliakrylamidowego. Uruchom elektroforezę, ułatwiając separację fragmentów RNA na podstawie wielkości.

Przenieś żel na wstępnie zwilżone bibuły filtracyjne na kasecie do elektrobibuły. Ułóż nasączoną buforem nylonową membranę bibułową na żelu. Następnie ułóż wstępnie zwilżone bibuły filtracyjne. Wykonaj elektrobloty.

Prąd elektryczny powoduje, że ujemnie naładowany RNA, w tym miRNA, przemieszcza się z żelu na dodatnio naładowaną powierzchnię membrany nylonowej. Wystaw membranę na działanie światła ultrafioletowego; to sieciuje RNA z błoną, zapobiegając w ten sposób utracie RNA.

Inkubować błonę w buforze hybrydyzacyjnym zawierającym środki blokujące, które zajmują niespecyficzne miejsca wiązania w celu zmniejszenia szumu tła.

Dodaj znakowaną radioaktywnie sondę oligonukleotydową RNA komplementarną do docelowego miRNA, aby związać się z nią specyficznie. Umyj membranę buforem, usuwając niezwiązane sondy.

Użyj systemu obrazowania luminoforowego, aby wykryć i określić ilościowo intensywność sygnału hybrydyzacji radioaktywnej. Sygnał o wysokiej rozdzielczości wskazuje na specyficzną ekspresję miRNA w tkance roślinnej.

Zatrzymaj wstępny bieg żelu.

Dokładnie umyj studzienki przed załadowaniem próbki, aby usunąć osady mocznika z wnętrza studzienek. Podgrzewać zawieszone próbki RNA w temperaturze 98 stopni przez 1 minutę. Załaduj gorące próbki do studzienek za pomocą końcówek kapilarnych. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Zakończ ładowanie wszystkich próbek i załóż pokrywę. Uruchom żel pod napięciem 80 woltów przez 3 godziny lub do momentu, gdy błękit bromofenolowy całkowicie zniknie. Do transferu użyj dodatnio naładowanej membrany nylonowej. Przytnij go do wymiarów szklanej płyty. Oznacz membranę w prawym górnym rogu. Delikatnie umieść membranę na powierzchni sterylnej wody Milli-Q. Upewnij się, że etykieta jest umieszczona stroną skierowaną w dół, skierowaną w stronę powierzchni wody.

Weź czystą tacę i przygotuj żelową kanapkę do elektrotransferu. Umieść szarą stronę kasety w dół. Wlej 1X TBE nieco powyżej poziomu kasety. Wstępnie zwilż podkładkę z włókna w 1X TBE i ściśnij ją, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Wytnij dwa kawałki bibuły do rozmiaru podkładki z włókna.

Wstępnie zwilż kawałek bibuły w 1X TBE i umieść go na podkładce z włókna. Usuń pęcherzyki powietrza, tocząc plastikową pipetę po papierze. Wstępnie zwilż kolejny kawałek bibuły w jednym 1X TBE i połóż go na kasecie. Przewrócenie w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Teraz zestaw kanapkowy jest gotowy do elektrotransferu.

Po zakończeniu elektroforezy zatrzymaj bieg i zdejmij pokrywę z aparatu. Wyjmij kasetę biegową z konfiguracji. Wyjmij szklane płytki z kasety jezdnej.

Ostrożnie wyjmij żel z zespołu. Połóż go na bibule tak, aby pierwsza załadowana próbka RNA znajdowała się po prawej stronie. Delikatnie zanurz wstępnie nasączoną membranę w 1X TBE i umieść ją na żelu stroną skierowaną do etykiety w dół. Nie dopuścić do wyschnięcia membrany i żelu. Delikatnie przewróć na drugą stronę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Zanurz jeden kawałek bibuły w 1X TBE i połóż go na membranie. Usuń pęcherzyki powietrza. Umieść kolejny kawałek bibuły i usuń pęcherzyki powietrza. Uzupełnij kanapkę, kładąc podkładkę z włókna na zespole. Mocno zamknij kasetę.

Umieść kasetę transblot w module. Napełnij zbiornik 1X TBE, pH 8,2, aż do znaku bibuły. Zamknij pokrywę aparatu i przenieś pod napięciem 10 V przez noc w temperaturze 4 stopni lub w chłodnym pomieszczeniu. Utrzymuj sieciownik UV w gotowości i ustaw go na 1,200 tuż przed zakończeniem elektrotransferu.

Po zakończeniu przenoszenia wyjmij kasetę z modułu. Umieść wilgotną membranę na arkuszu A4, kładąc zaznaczoną stroną do góry. Usieciuj RNA z błoną przez napromieniowanie światłem UV o długości 254 nanometrów o średnicy 120 milidżuli. Usieciowany blot może być przechowywany w temperaturze 4 stopni lub używany do hybrydyzacji.

Zaprojektuj sondę, która jest całkowicie komplementarna z małym RNA, które ma zostać wykryte, i oznacz sondę na jej 5 pierwszym końcu za pomocą enzymu PNK i połącz składniki, jak pokazano. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 stopni przez 30 minut.

Po 30 minutach inkubacji użyj kolumn G-25 do oddzielenia nieznakowanych sond od mieszaniny reakcyjnej. Aby poprawić etykietowanie sondy, przygotuj kolumnę G-25 przed użyciem. Umieść blot, RNA stroną do góry, w butelce do hybrydyzacji. Przed użyciem energicznie wymieszać bufor hybrydyzacyjny. Dodać 10 ml buforu do hybrydyzacji i umieścić butelkę do hybrydyzacji w piecu do hybrydyzacji utrzymywanym w temperaturze 35 stopni z obrotem.

Wykonuj wstępną hybrydyzację przez 20 do 30 minut. Po wstępnej hybrydyzacji wyjmij butelkę z piekarnika. Delikatnie dodaj oznakowaną sondę do buforu hybrydyzacyjnego. Upewnij się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Inkubuj blot w piekarniku w temperaturze 35 stopni z obrotem przez 12 godzin.

Po hybrydyzacji usuń bufor hybrydyzacyjny z butelki. Wykonać szybkie płukanie blotów za pomocą buforu do płukania I. Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia nadmiaru roztworu hybrydyzacyjnego z plam. Następnie inkubować bloty w temperaturze 35 stopni przez 30 minut, używając buforu do przemywania I. Przeprowadzić kolejne płukanie przy użyciu buforu II w temperaturze 35 stopni przez 30 minut.

Po zmyciu blota umieść go w pokrywie hybrydyzacyjnej, usuń nadmiar buforu i zamknij. Umieść go w kasecie i wystaw na 12 godzin na ekranie obrazowania luminoforowego bez promieniowania. Wykryj sygnał hybrydyzacji za pomocą Typhoon Biomolecular Imager i przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania ImageJ.