Obrazowanie FLIM-FRET w celu scharakteryzowania interakcji białko-białko u żywych bakterii
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:26 min. • July 8th, 2025
Aby zbadać specyficzne interakcje białko-białko u żywych bakterii za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji, FLIM, w połączeniu z transferem energii rezonansu Förster, FRET, należy rozpocząć od rekombinowanej zawiesiny bakteryjnej. Bakterie wyrażają specyficzne białka cytoplazmatyczne zaangażowane w szlaki metaboliczne, znakowane białkami fluorescencyjnymi donorowymi i akceptorowymi odpowiednimi dla FRET.
Umieść zawiesinę bakteryjną na waciku agarozowym, która unieruchamia bakterie na szkiełku mikroskopowym. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i zamknij.
Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu skaningowego z odwróconym wzbudzeniem dwufotonowym do mikroskopii FLIM-FRET. Użyj lampy fluorescencyjnej, aby wybrać i zeskanować interesujący obszar na monowarstwie bakteryjnej.
Interakcja między eksprymowanymi białkami cytoplazmatycznymi zbliża do siebie białka fluorescencyjne donorowe i akceptorowe w odpowiedniej orientacji. Po naświetleniu laserem o odpowiedniej długości fali, białko fluorescencyjne dawcy zostaje wzbudzone.
Bliskie sąsiedztwo białek fluorescencyjnych wyzwala FRET, co prowadzi do nieradiacyjnego transferu energii od dawcy do akceptora białek
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych