JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:49 min. • July 8th, 2025
Rozpocznij test ligacji zbliżeniowej, biorąc wypreparowane nicienie i utrwalając je na szkiełku z odsłoniętymi komórkami linii rozrodczej. Komórki te wykazują wysoki poziom kompleksów rybonukleoproteinowych zawierających białka wiążące RNA, RBP, związane z białkami partnerskimi.
Na szkiełko należy nałożyć dwa pierwszorzędowe przeciwciała, które rozpoznają dwa specyficzne białka docelowe — RBP i jego białko partnerskie. Uzupełnij szkiełko dwoma typami przeciwciał drugorzędowych specyficznych dla odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych.
Każde przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z sondami PLA — niciami DNA z sekwencjami komplementarnymi. Przeciwciała drugorzędowe wiążą się z wcześniej przyłączonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi, zbliżając do siebie dwie sondy PLA.
Zastosuj bufor ligacyjny zawierający oligonukleotydy łącznikowe - które hybrydyzują z sondami PLA - a enzym ligazy uszczelni lukę, tworząc koliste DNA. Inkubować szkiełko z roztworem amplifikacyjnym zawierającym polimerazę DNA, dNTP i sondy detektorowe podłączone do czerwonego fluoroforu.
Wykorzystując koliste DNA jako matrycę, polimeraza inicjuje amplifikację toczącego się koła, generując wiele kopii matrycowego DNA połączonych ze sobą. Amplifikowane DNA pozostaje przywiązane do sondy PLA, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko.
Sondy detektorowe, przenoszące krótkie jednoniciowe oligonukleotydy, oddziałują z komplementarnymi regionami amplifikowanego DNA, tworząc dupleksy i przekazując sygnały fluorescencyjne do kompleksów białkowych. Zobrazuj szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Obserwuj wyraźne czerwone plamki wewnątrz komórki, wskazujące na udane interakcje białko-białko.
Użyj rozcieńczalnika przeciwciał, aby rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe. Nałożyć na szkiełka 40 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na przestrzeń 14 na 14 milimetrów. Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Rano umyj szkiełka dwukrotnie przez 5 minut każde 50 mililitrami 1x buforu do mycia A w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min. Umieść szkiełka na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie.
Przygotuj 40-mikrolitrowy roztwór zawierający sondy plus i minus. Dodaj roztwór do każdej przestrzeni o wymiarach 14 na 14 milimetrów. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj szkiełka dwukrotnie przez 5 minut, każde z 50 mililitrami 1x buforu do mycia A w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin.
Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min. Rozcieńczyć bufor ligacyjny 1 do 5 ultraczystą wodą. Użyj tego buforu do rozcieńczenia ligazy od 1 do 40 w celu przygotowania roboczego roztworu do ligacji. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął po bokach i delikatnie wytrzyj krawędzie.
Dodaj 40 mikrolitrów roztworu do podwiązania do każdej przestrzeni o wymiarach 14 na 14 milimetrów. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po umyciu i wysuszeniu szkiełek zgodnie z wcześniejszym opisem, do każdej przestrzeni o wymiarach 14 na 14 milimetrów dodać 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu wzmacniającego chronionego przed światłem.
Inkubuj szkiełka w wilgotnej ciemnej komorze przez 1 godzinę i 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj szkiełka dwukrotnie przez 10 minut każde 50 mililitrami 1x buforu do płukania B i umyj szkiełka jeden raz przez 1 minutę 50 mililitrami 0,01x buforu B.
Po narysowaniu obwodu szkiełka pokrytego żywicą epoksydową, dodaj 10 mikrolitrów podłoża montażowego do każdej próbki i delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu, pozwalając na rozprowadzenie się podłoża mocującego. Pomaluj krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i szkiełko. Unikaj przesuwania szkiełka nakrywkowego. Pozwól lakierowi do paznokci stwardnieć przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.