Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Rozpocznij test ligacji zbliżeniowej, biorąc wypreparowane nicienie i utrwalając je na szkiełku z odsłoniętymi komórkami linii rozrodczej. Komórki te wykazują wysoki poziom kompleksów rybonukleoproteinowych zawierających białka wiążące RNA, RBP, związane z białkami partnerskimi.

Na szkiełko należy nałożyć dwa pierwszorzędowe przeciwciała, które rozpoznają dwa specyficzne białka docelowe — RBP i jego białko partnerskie. Uzupełnij szkiełko dwoma typami przeciwciał drugorzędowych specyficznych dla odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych.

Każde przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z sondami PLA — niciami DNA z sekwencjami komplementarnymi. Przeciwciała drugorzędowe wiążą się z wcześniej przyłączonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi, zbliżając do siebie dwie sondy PLA.

Zastosuj bufor ligacyjny zawierający oligonukleotydy łącznikowe - które hybrydyzują z sondami PLA - a enzym ligazy uszczelni lukę, tworząc koliste DNA. Inkubować szkiełko z roztworem amplifikacyjnym zawierającym polimerazę DNA, dNTP i sondy detektorowe podłączone do czerwonego fluoroforu.

Wykorzystując koliste DNA jako matrycę, polimeraza inicjuje amplifikację toczącego się koła, generując wiele kopii matrycowego