Trawienie białek na błonie w celu przygotowania białek współimmunoprecypitowanych do badań interakcji

Aby przeprowadzić trawienie na błonie, należy pobrać roztwór koimmunoprecypitowanych kompleksów białkowych, z których każdy zawiera rekombinowane białko docelowe znakowane GFP związane z białkiem partnerskim.

Przenieść białka do probówki zawierającej wstępnie zwilżony polifluorek winylidenu, membranę PVDF i inkubować. Hydrofilowa powierzchnia membrany PVDF pomaga w przenoszeniu białek na błonę.

Przenieś błonę zawierającą białko do świeżej probówki. Dodać bufor zawierający środek redukujący, aby zmniejszyć wiązania dwusiarczkowe między resztą cysteiny, prowadząc do denaturacji poszczególnych białek w kompleksach bez zakłócania ich interakcji.

Zastąp ten roztwór odczynnikiem alkilującym, który alkiluje grupę sulfhydrylową obu białek w kompleksach i zapobiega powstawaniu wiązań dwusiarczkowych. Umyj membranę, aby usunąć nadmiar odczynnika.

Potraktuj błonę buforem zawierającym trypsynę - enzym proteolilityczny. Trypsyna rozszczepia białko docelowe znakowane GFP i jego białko partnerskie na końcu karboksylowym reszt argininy i lizyny, uwalniając mniejsze peptydy do supernatantu. Przenieść supernatant do świeżej probówki.

Umyj membranę kwaśnym roztworem, dysocjując wszelkie związane pept