Trawienie białek na błonie w celu przygotowania białek współimmunoprecypitowanych do badań interakcji

Aby przeprowadzić trawienie na błonie, należy pobrać roztwór koimmunoprecypitowanych kompleksów białkowych, z których każdy zawiera rekombinowane białko docelowe znakowane GFP związane z białkiem partnerskim.

Przenieść białka do probówki zawierającej wstępnie zwilżony polifluorek winylidenu, membranę PVDF i inkubować. Hydrofilowa powierzchnia membrany PVDF pomaga w przenoszeniu białek na błonę.

Przenieś błonę zawierającą białko do świeżej probówki. Dodać bufor zawierający środek redukujący, aby zmniejszyć wiązania dwusiarczkowe między resztą cysteiny, prowadząc do denaturacji poszczególnych białek w kompleksach bez zakłócania ich interakcji.

Zastąp ten roztwór odczynnikiem alkilującym, który alkiluje grupę sulfhydrylową obu białek w kompleksach i zapobiega powstawaniu wiązań dwusiarczkowych. Umyj membranę, aby usunąć nadmiar odczynnika.

Potraktuj błonę buforem zawierającym trypsynę - enzym proteolilityczny. Trypsyna rozszczepia białko docelowe znakowane GFP i jego białko partnerskie na końcu karboksylowym reszt argininy i lizyny, uwalniając mniejsze peptydy do supernatantu. Przenieść supernatant do świeżej probówki.

Umyj membranę kwaśnym roztworem, dysocjując wszelkie związane peptydy od membrany, zapewniając całkowitą ekstrakcję. Przeciągnij frakcje zawierające peptydy do jednej probówki. Wysuszyć przez suszenie próżniowe.

Zawiesić reszty w niskim stężeniu kwasu mrówkowego, rozpuszczając peptydy, które są gotowe do identyfikacji interakcji białko-białko.

Aby przygotować membranę, należy pociąć membrany PVDF na kawałki o wymiarach 3 na 3 milimetry za pomocą nożyczek chirurgicznych, które zostały oczyszczone bezpośrednio przed użyciem. Umieść kawałki membrany na folii aluminiowej i dodaj od 2 do 5 mikrolitrów etanolu do każdego kawałka. Zanim membrany całkowicie wyschną, dodaj od 2 do 5 mikrolitrów eluantu białkowego do każdego kawałka i wysusz je na powietrzu, aż powierzchnia membrany stanie się matowa.

Następnie przenieś membrany do 1,5-mililitrowych probówek i przechowuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza. W przypadku użycia od razu dodaj od 2 do 30 mikrolitrów etanolu, co sprawi, że będą hydrofilowe. Usuń etanol za pomocą pipety. Ale zanim membrany wyschną, całkowicie dodaj 200 mikrolitrów roztworu reakcyjnego na bazie DTT do każdej probówki i inkubuj je w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji zastąp roztwór reakcyjny 300 mikrolitrami roztworu jodoacetamidu i inkubuj w ciemności przez 45 minut. Następnie przemyj membrany dwukrotnie wodą destylowaną i raz 2% acetonitrylem przez wirowanie przez co najmniej 10 sekund.

Praca z ditiotreitolem i acetonitrylem może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania procedury trawienia na błonie należy zawsze nosić maskę, okulary i rękawiczki.

Przygotuj trypsynę zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodaj 100 mikrolitrów roztworu reakcyjnego trypsyny do każdej membrany. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia.

Następnego dnia przenieś roztwór reakcyjny do czystej 1,5-mililitrowej probówki i dodaj 100 mikrolitrów umytych roztworów do membrany. Inkubować błonę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie zbierz przemyty roztwór i wymieszaj go z roztworem reakcyjnym. Dodaj kolejne 100 mikrolitrów umytego roztworu do membrany i poddawaj go sonikacji przez 10 minut. Następnie zbierz przemyty roztwór i wymieszaj go z roztworem reakcyjnym. Przykryj probówkę kawałkiem folii laboratoryjnej i wykonaj małe otwory w folii za pomocą igły.

Wysuszyć roztwór za pomocą koncentratora próżniowego i rozpuścić pozostałość w 10 mikrolitrach 0,2% kwasu mrówkowego. Odwirować probówkę o masie 12 000 x g przez trzy minuty i przenieść supernatant do probówki z próbką.

Analizować próbkę za pomocą spektrometru mas połączonego z systemem nano-LC HPLC.