Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Interakcje komórka-komórka - za pośrednictwem białek na sąsiednich powierzchniach komórek - mogą być badane w żywych komórkach za pomocą testu spektroskopii fluktuacji fluorescencji.

Po pierwsze, weź oddzielne hodowle komórkowe z ekspresją receptora adhezyjnego - białka transbłonowego. Receptor w komórkach z obu populacji jest znakowany separowanymi spektralnie białkami fluorescencyjnymi. Te fluorescencyjne znaczniki są obecne w obszarze cytoplazmatycznym receptora, zapobiegając interferencji interakcji komórka-komórka.

Wyrzuć pożywkę i dodaj trypsynę, ułatwiając odrywanie komórek. Wymieszaj dwie populacje komórek i inkubuj, pozwalając receptorom sąsiednich komórek na utworzenie homotypowych interakcji trans.

Umieść komórki pod mikroskopem konfokalnym. Oświetlić próbkę za pomocą źródeł laserowych o odpowiednich długościach fal, powodując emisję z obu etykiet fluorescencyjnych. Zlokalizuj dwie sąsiednie komórki z różnokolorowymi sygnałami fluorescencyjnymi w kontakcie.

Uzyskaj skan liniowy - prostopadły do obszaru błon komórkowych w kontakcie - przy użyciu kanału widmowego obu znaczników fluorescencyjnych. Laser skupia się na niewielkiej objętości próbki — objętości detekcji. Gdy receptory znakowane fluorescencyjnie dyfundują do i z objętości detekcji, intensywność fluorescencji ulega wahaniom.

Jeśli receptory sąsiednich komórek nie oddziałują na siebie, poruszają się indywidualnie, co prowadzi do niezależnych wahań intensywności ich fluorescencji z niską korelacją krzyżową.

Jeśli sąsiadujące ze sobą komórki oddziałują za pośrednictwem swoich receptorów, oddziałujące białka dyfundują razem, powodując skorelowane wahania intensywności ich fluorescencji.

Przenieś roztwór komórkowy z jednej studzienki do odpowiedniego dołka. Delikatnie wymieszaj, pipetując kilka razy w górę iw dół, a następnie wymieszaj komórki na 35-mililitrowym naczyniu ze szklanym dnem i hoduj zasiane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez jeden dzień.

W oprogramowaniu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego ustaw ścieżkę optyczną. Aby uniknąć przesłuchów spektralnych, wybierz dwie oddzielne ścieżki, aby wzbudzić i wykryć sekwencyjnie mEGFP lub mEYFP i mCherry lub mCardinal, a następnie wybierz "Przełącz ścieżki co linię". Do wykrywania użyj odpowiednich filtrów dla obu kanałów.

Umieścić naczynie zawierające wymieszane komórki na uchwycie na próbkę. Po odczekaniu 10 minut, aby zapewnić równowagę temperatury i zmniejszyć dryft ostrości, skup się na komórkach za pomocą światła transmisyjnego w menu "Zlokalizuj". Wyszukaj parę "czerwonych" i "zielonych" komórek, które stykają się ze sobą.

Następnie wybierz ścieżkę skanowania prostopadłą do kontaktu komórka-komórka za pomocą przycisku "Przytnij". "Zoom", aby osiągnąć rozmiar piksela od 50 do 200 nanometrów i wybierz "Linia" w "Trybie skanowania". Ustaw "Rozmiar ramki" na 128 na 1 piksele. Ustaw "Szybkość skanowania" na maksymalną dozwoloną wartość, a następnie ustaw cykle na 100 000 do 500 000.

Następnie wybierz odpowiednie moce lasera. Ustaw detektory w trybie "Zliczanie fotonów". Naciśnij "Rozpocznij eksperyment", aby rozpocząć akwizycję.