Biotynylowana sonda peptydowa penetrująca komórki do wykrywania interakcji białko-białko
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 6:15 min. • July 8th, 2025
W komórkach białka wiążą się z białkami oddziałującymi ze sobą poprzez określone sekwencje w ich strukturze ― modulując wewnątrzkomórkowe funkcjonowanie białek.
Aby wykryć wewnątrzkomórkowe interakcje białek, weź przylegającą hodowlę komórkową. Zassać pożywkę.
Dodaj biotynylowany peptyd penetrujący komórki, roztwór BCPP i inkubuj.
Każdy BCPP zawiera sekwencję peptydową, która pomaga w specyficznym wiązaniu się z docelowym białkiem wewnątrzkomórkowym. Peptyd zawiera peptyd penetrujący komórkę, CPP, na N-końcu peptydu i biotynę na C-końcu, co ułatwia wykrycie.
Podczas inkubacji dodatnio naładowany region CPP ułatwia wejście związanego peptydu przez błonę komórki, docierając do cytoplazmy. Peptyd wiąże się ze swoim wewnątrzkomórkowym partnerem białkowym oddziałującym - tworząc kompleks białkowy BCPP-cel.
Dodaj bufor zawierający cząsteczki detergentu, które rozrywają błonę komórkową i uwalniają kompleksy białkowe BCPP-target oraz inne składniki komórkowe.
Dodać roztwór awidyny związanej z kulkami agarozy — glikoproteiny, która specyficznie wiąże się z biotyną w BCPPs. Inkubować, umożliwiając nieodwracalne wiązanie awidyny z biotyną i oczyszczając kompleksy białkowe awidyna-BCPP-cel.
Wi
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych