JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 6:15 min. • July 8th, 2025
W komórkach białka wiążą się z białkami oddziałującymi ze sobą poprzez określone sekwencje w ich strukturze ― modulując wewnątrzkomórkowe funkcjonowanie białek.
Aby wykryć wewnątrzkomórkowe interakcje białek, weź przylegającą hodowlę komórkową. Zassać pożywkę.
Dodaj biotynylowany peptyd penetrujący komórki, roztwór BCPP i inkubuj.
Każdy BCPP zawiera sekwencję peptydową, która pomaga w specyficznym wiązaniu się z docelowym białkiem wewnątrzkomórkowym. Peptyd zawiera peptyd penetrujący komórkę, CPP, na N-końcu peptydu i biotynę na C-końcu, co ułatwia wykrycie.
Podczas inkubacji dodatnio naładowany region CPP ułatwia wejście związanego peptydu przez błonę komórki, docierając do cytoplazmy. Peptyd wiąże się ze swoim wewnątrzkomórkowym partnerem białkowym oddziałującym - tworząc kompleks białkowy BCPP-cel.
Dodaj bufor zawierający cząsteczki detergentu, które rozrywają błonę komórkową i uwalniają kompleksy białkowe BCPP-target oraz inne składniki komórkowe.
Dodać roztwór awidyny związanej z kulkami agarozy — glikoproteiny, która specyficznie wiąże się z biotyną w BCPPs. Inkubować, umożliwiając nieodwracalne wiązanie awidyny z biotyną i oczyszczając kompleksy białkowe awidyna-BCPP-cel.
Wirować do granulowania kulek. Ponownie zawiesić kulki w buforze, aby rozszczepić niekowalencyjne wiązania między białkami i wymyć kompleksy CPP-peptyd-białko z kulek biotyny-awidyny.
Analizuj kompleksy CPP-peptyd-białko za pomocą western blot. Wyższy zakres masy cząsteczkowej dla kompleksu CPP-peptyd-białko niż składniki kompleksu wskazuje na udaną interakcję między oddziałującymi partnerami białkowymi.
Dodać objętość roztworu podstawowego BCPP do kultur komórkowych, aby osiągnąć stężenie, które okazało się skuteczne.
Dlatego dodaj 92,8 mikrolitrów po 2 miligramy na mililitr TAT-Connexin-43266-283-Biotyny na mililitr pożywki hodowlanej. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 30 minut, aby upewnić się, że zachodzą interakcje między BCPP a jego wewnątrzkomórkowymi partnerami.
Aby przeprowadzić ekstrakcję białka, najpierw całkowicie odessaj pożywkę hodowlaną. Następnie umyj komórki 10 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na 150 centymetrów, bardzo ostrożnie, aby uniknąć oderwania komórek.
Aby uzyskać lizat komórkowy, dodaj 3 mililitry buforu do lizy na kolbę o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych i dokładnie zeskrob powierzchnię za pomocą skrobaka do komórek. Przechylenie kolby pod kątem około 45 stopni ułatwi zebranie lizatów komórkowych do odpowiednich probówek.
Wlej 1 mililitr lizatu komórkowego na probówkę do 3 1,5-mililitrowych probówek oznaczonych według warunku. W celu obniżenia należy odwirować 1,5-mililitrowe probówki o stężeniu 11 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Przenieść supernatanty do nowych probówek oznaczonych A. Przenieść podwielokrotność supernatantu na warunek do różnych probówek oznaczonych B. Następnie dodaj 16,6 mikrolitra 4x buforu Laemmli na 50 mikrolitrów lizatu i zamroź w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie bardzo dobrze homogenizuj agarozę NeutrAwidyny poprzez delikatne potrząsanie.
Odetnij końcówki końcówek pipet, aby zwiększyć ich średnicę i poprawić pipetowanie kulek. Następnie dodaj 50 mikrolitrów agarozy NeutrAvidin na mililitr lizatu komórkowego w probówkach A. Inkubuj lizaty komórkowe w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc, bardzo delikatnie wstrząsając, aby umożliwić NeutrAvidin interakcję z BCPP związanymi z ich wewnątrzkomórkowymi partnerami.
Następnie odwirować w temperaturze 3000 razy g przez 1 minutę w temperaturze 4% stopni Celsjusza, aby zebrać kompleks NeutrAwidyny z białkami. Ostrożnie usunąć supernatanty i przenieść je do czystych probówek oznaczonych C. Zachowaj je do użycia na wypadek, gdyby ściąganie się nie powiodło.
Aby przepłukać kompleks NeutrAwidin białkami, dodaj świeży bufor do lizy do granulek probówek A. Ponownie zawiesić osad przez odwrócenie i powtórzyć wirowanie. Powtórz to pranie jeszcze pięć razy. Wszystkie te supernatanty można odrzucić.
Następnie dodaj 40 mikrolitrów 2x buforu Laemmli na 1,5-mililitrową probówkę dla granulek uzyskanych ze 150 centymetrów kwadratowych kolb zlewających się komórek. Następnie eluuj w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 5 minut, aby zdysocjować interakcje między białkami.
Po elucji wirować przez 30 sekund w ilości 8 200 razy g, aby osadzać kulki NeutrAvidin. Przenieść supernatanty zawierające zdysocjowane białka z końcówkami kapilarnymi do nowych probówek oznaczonych D.
Supernatanty te są teraz gotowe do załadowania do Western blot zgodnie z opisem w protokole tekstowym lub do zamrożenia w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.