Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Tandemowe oczyszczanie powinowactwa to sekwencyjny schemat oczyszczania polegający na izolowaniu kompleksów białkowych z komórek w celu zbadania interakcji białko-białko.

Na początek weź hodowlę komórkową wyrażającą interesujące nas białka znakowane epitopami. Białka tworzą kompleks wewnątrz komórki. Jedno z białek w kompleksie zawiera znacznik paciorkowca, podczas gdy drugie jest znakowane znacznikiem FLAG. Są to małe syntetyczne znaczniki powinowactwa oparte na sekwencji peptydów.

Usuń pożywkę i dodaj roztwór detergentu, aby zlizować komórki. Odwirować, aby usunąć resztki komórkowe. Zebrać supernatant zawierający docelowy kompleks białkowy i inne białka komórkowe.

Dodaj paciorkowców — kulki agarozy pokryte streptawidyną — i inkubuj. Strep-tag kompleksu białkowego wiąże się ze streptawidyną. Odwirować w celu zebrania kulek związanych z kompleksem białkowym. Umyć w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających białek komórkowych.

Dodać bufor elucyjny zawierający destiobiotynę — pochodną biotyny — która wypiera kompleks białkowy poprzez konkurencyjne wiązanie się ze streptawidyną. Odwirować w celu otrzymania supernatantu zawierającego eluowany kompleks białkowy.

Dodaj kulki FLAG — kulki agarozy pokryte przeciwciałami anty-FLAG — i inkubować. Znacznik FLAG kompleksu białkowego wiąże się z przeciwciałem. Odwirować w celu zebrania kulek związanych z kompleksem białkowym.

Dodać bufor elucyjny zawierający wolny peptyd FLAG. Peptyd konkurencyjnie wiąże się z przeciwciałem i wypiera związany kompleks białkowy. Odwirować w celu wymycia oczyszczonego kompleksu białkowego.

Oceń obecność obu białek w elucji, aby potwierdzić interakcję między białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Po inkubacji lizatu komórkowego i zawiesiny STREP-perełkowej przez 2 godziny, wiruj je z prędkością 1,1500 g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zachowaj supernatant jako "przepływ AP STREP " i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Dodać 500 mikrolitrów STREP AP Wash Buffer 1 do kulek. Nutować kulki i mieszaninę buforową przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i odwirowywać w temperaturze 1500 razy g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie przemyć 500 mikrolitrami STREP AP Wash Buffer 1.

Po trzecim myciu przenieś roztwór kulek do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, aby zredukować tło białkowe. Umyj po raz czwarty za pomocą STREP AP Wash Buffer 1. Po odwirowaniu usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania 2.

Zrównoważ koraliki, odwracając rurki, a następnie wiruj w dół z prędkością 1,500 g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant. Eluować interesujące białko za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego STREP. Wiruj z prędkością 800 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Obracaj koraliki 1500 razy g przez 1 minutę w 4 stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant. Frakcja ta odpowiada próbce "STREP AP elucion".

Zachowaj frakcję kulek w temperaturze 4 stopni Celsjusza do drugiej elucji. Podwielokrotność 10% elucji STREP AP do barwienia srebrem i/lub western blot.

Aby zwiększyć ilość materiału wyjściowego do późniejszej immunoprecypitacji FLAG, pierwsza i druga elucja STREP mogą być połączone w celu bardziej efektywnego odzyskania elucji FLAG.

Rozpocznij tę procedurę od użycia końcówki pipety z szerokim otworem, aby przenieść odpowiednią ilość roztworu kulek FLAG do probówki mikrowirówkowej. Wiruj z prędkością 1,500 razy g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania FLAG do kulek.

Wiruj z prędkością 1,500 razy g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie przemyć buforem do płukania FLAG. Po trzecim przemyciu usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w buforze do płukania FLAG do końcowej objętości n razy 16 mikrolitrów, gdzie n jest liczbą próbek.

Dodaj 16 mikrolitrów zawiesiny perełkowej FLAG do pozostałej elucji STREP AP i znuźniaj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji gnojowicy perełkowej FLAG i elucji STREP AP należy przystąpić do immunoprecypitacji FLAG.

Obracaj zawieszenie koralików FLAG pod ciśnieniem 1,500 razy g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zachowaj supernatant jako "przepływ IP FLAG " i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania FLAG do kulek. Nutować przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i wirować w temperaturze 1500 razy g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie przemyć 500 mikrolitrami buforu do płukania FLAG.

Po trzecim płukaniu przenieś roztwór kulek białkowych do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, aby zredukować tło. Przemyć po raz czwarty buforem do płukania FLAG. Usunąć supernatant z ostatniego wirowania i dodać do kulek 30 mikrolitrów buforu do płukania FLAG zawierającego 200 nanogramów na mikrolitr peptydu FLAG. Wiruj z prędkością 800 obr./min przez dwie godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po dwóch godzinach odkręć zawieszenie z prędkością 1500 razy g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zbierz supernatant i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza jako "elucję FLAG IP".