Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Tandemowe oczyszczanie powinowactwa to sekwencyjny schemat oczyszczania polegający na izolowaniu kompleksów białkowych z komórek w celu zbadania interakcji białko-białko.

Na początek weź hodowlę komórkową wyrażającą interesujące nas białka znakowane epitopami. Białka tworzą kompleks wewnątrz komórki. Jedno z białek w kompleksie zawiera znacznik paciorkowca, podczas gdy drugie jest znakowane znacznikiem FLAG. Są to małe syntetyczne znaczniki powinowactwa oparte na sekwencji peptydów.

Usuń pożywkę i dodaj roztwór detergentu, aby zlizować komórki. Odwirować, aby usunąć resztki komórkowe. Zebrać supernatant zawierający docelowy kompleks białkowy i inne białka komórkowe.

Dodaj paciorkowców — kulki agarozy pokryte streptawidyną — i inkubuj. Strep-tag kompleksu białkowego wiąże się ze streptawidyną. Odwirować w celu zebrania kulek związanych z kompleksem białkowym. Umyć w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających białek komórkowych.

Dodać bufor elucyjny zawierający destiobiotynę — pochodną biotyny — która wypiera kompleks białkowy poprzez konkurencyjne wiązanie się ze streptawidyną. Odwirować w celu otrzymania supernatantu zawierającego eluowany kompleks białkowy.

Dodaj kulki FLAG — ku