Magnetyczny rezonans jądrowy do badania oddziaływań białko-białko na poziomie atomowym

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) umożliwia wykrywanie interakcji białko-białko na poziomie atomowym.

Aby zbadać interakcje między białkami globularnymi i spiralnymi, oznacz oczyszczone białka globularne typu dzikiego lub zmutowane za pomocą ¹⁵N - izotopu azotu. W probówce NMR wymieszaj znakowane białka kuliste i nieznakowane białka spiralne w rozpuszczalniku zawierającym wzorzec NMR. Włóż probówkę do spektrometru NMR.

Magnesy spektrometru generują silne pole magnetyczne, ustawiając ¹⁵znakowanych N kulistych jąder białek równolegle do pola. Impuls o częstotliwości radiowej lub RF wzbudza ¹⁵jąder N, aby ustawiły się antyrównolegle do pola.

Częstotliwość impulsów wymagana do przejścia ¹⁵jąder N między tymi dwoma stanami określa częstotliwość rezonansową. Normalizacja częstotliwości rezonansu ¹⁵N do wzorca NMR mierzy przesunięcie chemiczne ¹⁵N.

Pole magnetyczne jest dostosowane do ustawiania ¹jąder H - związanych z ¹⁵N - równolegle do pola. Impulsy RF są regulowane i rejestrowane jest przesunięcie chemiczne ^{o 1}H.

Podczas oddziaływań białkowych zmienia się środowisko chemiczne otaczające oddziałujące reszty aminokwasowe, zmieniając ^{wiązania chemiczne 15 N-1}H i odpowiadające im przesunięcia chemiczne. Wykreślić ^{widma 15 N-1}H NMR.

Bez białek helikalnych, białka globularne typu dzikiego wykazują dobrze rozdzielone piki widmowe. Kiedy białka kuliste typu helikalnego i dzikiego oddziałują ze sobą, pik widmowy ulega zmniejszeniu. W przeciwieństwie do tego, inkubacja białek helikalnych ze zmutowanymi białkami globularnymi powoduje ponowne pojawienie się pików widmowych, co wskazuje na brak interakcji między nimi.

Włącz przepływ powietrza za pomocą polecenia wysuwania "ej". Spowoduje to podniesienie próbki z magnesu. Teraz umieść próbkę w wirniku na magnesie w otworze. Wstaw za pomocą polecenia "ij". Zanim przejdziesz dalej, poczekaj, aż próbka osiądzie w magnesie.

Utwórz nowy zestaw danych za pomocą polecenia "edc" i załaduj standardowe parametry NMR protonu, wybierając eksperyment "ZGPR". Wypełnij pola nazwy, numeru eksperymentu i numeru folderu przetworzonych danych.

Wybierz rozpuszczalnik w polu "Ustaw rozpuszczalnik" i kliknij "Wykonaj "getprosol", aby odczytać standardowe parametry zależne od głowicy sondy i rozpuszczalnika. Zablokuj próbkę w deuterowanym rozpuszczalniku za pomocą polecenia "Zablokuj" i poczekaj, aż zakończy zamiatanie i osiągnie blokadę.

Skoryguj częstotliwość rezonansową magnesu, dostrajając próbkę za pomocą automatycznego polecenia strojenia "atma". Monitoruj krzywą chybotania, aż do zakończenia automatycznego strojenia.

Podkładka pod pole magnetyczne za pomocą "TOPSHIM". Shimming dostosowuje się do pola magnetycznego w celu uzyskania jednorodności wokół próbki. Dobrą praktyką jest przechowywanie tych samych wartości za pomocą polecenia "wsh" i odczytywanie ich za pomocą "rsh" przed topshim, jeśli używasz tych samych lub podobnych próbek.

Teraz dostosuj wzmocnienie odbiornika za pomocą polecenia "rga", aby osiągnąć maksymalny stosunek sygnału do szumu. Umieść środek widma na przesunięciu rezonansu wody i ustaw impuls protonu o kącie 90 stopni na dużą moc za pomocą "calibo1p1".

Zbierz widmo protonów za pomocą polecenia Zero Go "zg" i przetwarzaj za pomocą "efp". Obejmuje to mnożenie wykładnicze, rozpad swobodnej indukcji obejmujący poszerzenie linii, transformację Fouriera FID i "pk" w celu zastosowania korekcji fazy.

Zastosuj automatyczną korekcję fazy "apk" i automatyczną korektę linii bazowej "absn" przy użyciu opcji wielomianu bez całkowania. Utwórz nowy zestaw danych dla eksperymentu SOFAST HMBC, wybierając opcję "SFHMQC3GPPH" w eksperymencie.

Skopiuj zoptymalizowane P1 i O1 z widma protonów i wypełnij impulsy zależne od P1 za pomocą polecenia "getprosol 1H p1 plw1", gdzie P1 to zoptymalizowana wartość P1, a plw1 to poziom mocy dla P1. Teraz zoptymalizuj stałą CNST54, aby ustawić przesunięcie chemiczne amidu. Zoptymalizuj również CNST55, aby zdefiniować szerokość pasma w celu objęcia interesujących nas obszarów spektralnych, co pozwala na optymalizację wzmocnienia odbiornika.

Aby wybrać te parametry, wyodrębnij pierwszy FID z dwuwymiarowego widma i poszukaj obserwowanego sygnału, aby je zdefiniować. Ponadto zmieniaj opóźnienie relaksacji, liczbę skanów i fikcyjne skanowania, aby uzyskać akceptowalną czułość sygnału za pomocą polecenia "gs", które umożliwia go and scan w celu monitorowania jakości danych w czasie rzeczywistym. Na koniec zapisz widma za pomocą Zero Go "zg".