Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do wyboru białek o wysokim powinowactwie do białka docelowego

Rozpocznij wyświetlanie fagów od dodania biblioteki fagów do studzienek płytki wielodołkowej, pokrytej białkiem docelowym. Biblioteka fagów zawiera genetycznie zmodyfikowane fagi, z których każdy wyświetla indywidualny wariant białka połączony z białkiem płaszcza na swojej powierzchni. Inkubuj, umożliwiając interakcję faga i białek docelowych.

Fagi z białkami o wysokim powinowactwie do białek docelowych wiążą się z białkiem docelowym. Przemyć buforem, usuwając niezwiązane fagi. Dodaj kwaśny roztwór, zakłócając interakcje faga i białka docelowego, uwalniając fagi do roztworu. Zneutralizować pH roztworu za pomocą buforu, utrzymując stabilność faga.

Przenieś fagi do świeżej probówki. Inkubować z roztworem blokującym zawierającym białka, zapobiegając niespecyficznym interakcjom.

Przenieś fagi do aktywnie dzielącej się zawiesiny E. coli, infekując bakterie i inicjując cykl replikacji faga. Suplement z fagami pomocniczymi, które infekują bakterie, dostarczając białek okrywy niezbędnych do pakowania fagów potomnych. Przenieść zawiesinę do selektywnej pożywki, umożliwiając wzrost bakterii zakażonych fagami.

Fagi potomne są w końcu uwalniane do pożywki. Wirówka. Zebrać supernatant zawierający fagi. Dodać roztwór strącający, zagęszczając cząsteczki fagów. Wirówka. Zawiesić osad faga w buforze, uzyskując jednorodną zawiesinę.

Wykonaj kolejne rundy selekcji fagów; powtórzyć wiązanie faga-białko docelowe, elucję ze zwiększonym krokiem rygorystyczności płukania buforu oraz etapy amplifikacji i wirowania, co skutkuje wzbogaceniem pul fagowych wykazujących białka o wysokim powinowactwie do białka docelowego.

Rozmrozić bibliotekę fagów na lodzie. Następnie rozcieńcz go do 100-krotności różnorodności biblioteki w PBS. Dodać roztwór glikolu polietylenowego/chlorku sodu w 1/5 rozcieńczonej objętości biblioteki i inkubować roztwór na lodzie przez 30 minut. Następnie odwirować roztwór o stężeniu 11 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i odwirować go przez kolejne dwie minuty, aby ściągnąć pozostały supernatant i skoncentrować osad faga.

Delikatnie ponownie zawiesić osad faga w jednym mililitrze buforu PBT na białko docelowe do analizy, zazwyczaj w sumie cztery. Dodać 100 mikrolitrów biblioteki fagów do każdej powlekanej studzienki na płytce kontrolnej. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.

Wyrzuć bufor PB z płytki docelowej do zlewu i osusz płytę na ręcznikach papierowych. Przenieść wszystkie 100 mikrolitrów biblioteki fagów z płytki kontrolnej do każdego powlekanego dołka płytki docelowej. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.

Następnie wyjmij bibliotekę fagów z płytki i przemyj powlekane studzienki czterokrotnie buforem PT. Odwróć talerz i postukaj w ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie krople buforu. Dodaj 100 mikrolitrów 0,1-molowego kwasu solnego do każdej pokrytej studzienki, aby wymyć. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut z wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 300 obr./min.

Następnie zneutralizuj pH, dodając 12,5 mikrolitra pH 11 jednego molowego chlorowodorku Tris do każdej powlekanej studzienki. Przenieś eluowany ze wszystkich ośmiu studzienek do jednej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Podczas przenoszenia pipetować w górę i w dół, aby roztwory były jednorodne, i odsysać cały płyn z dołków. Dodać 10% BSA do eluowanego faga, aby uzyskać końcowe stężenie 1%.

Probówkę do mikrowirówki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. To jest okrągłe pierwsze wyjście. Przygotować kulturę nasion do hodowli faga wejściowego do następnej rundy selekcji, zaszczepiając pięć mililitrów kultury nasion 2YT/tetracykliny izolowaną kolonią E. coli z płytki agarowej.

Inkubuj go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min. Rozcieńczyć białko docelowe w drugiej i trzeciej probówce odpowiednią ilością PBS. Weź połowę zawartości drugiej i trzeciej rundy probówki i pokryj cztery dołki na docelowe białko w 96-dołkowej płytce wiążącej na następną rundę.

Następnie użyj połowy okrągłego jednego wyjścia, aby zaszczepić trzy mililitry komórek w środkowej fazie logarytmicznej. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min. Dodaj M13KO7 Helper Phage do końcowego stężenia 10 miliardów pfu na mililitr. Inkubuj go ponownie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.

Po godzinie przenieś całe trzy mililitry kultury do 30 mililitrów roztworu 2YT/karbenicyliny/kanamycyny. Rośnie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.