Immunoprecypitacja chromatyny w celu identyfikacji docelowych miejsc wiązania białek w genomowym DNA

Aby zidentyfikować miejsca wiązania białka docelowego na DNA, należy rozpocząć od komórek prekursorowych oligodendrocytów zawierających białko docelowe usieciowane ze specyficznymi sekwencjami DNA w chromatynie.

Potraktuj komórki buforem do lizy zawierającym inhibitory proteazy. Bufor do lizy komórek ulega lizie, podczas gdy inhibitory dezaktywują proteazy, aby zachować integralność kompleksów białko-chromatyna.

Sonikować zawartość, aby ścinać kompleksy na mniejsze fragmenty chromatyny, przy czym niektóre z nich zachowują białko docelowe.

Odwirować w celu osadzenia składników komórkowych i przenieść supernatant zawierający fragmenty chromatyny do świeżej probówki. Inkubować z przeciwciałami anty-docelowymi, które specyficznie wiążą się z białkiem docelowym na fragmentach chromatyny.

Uzupełnij probówkę kulkami magnetycznymi pokrytymi białkiem A, które wiążą się z regionem Fc wstępnie związanych przeciwciał. Zastosuj pole magnetyczne, aby selektywnie wytrącić białka docelowe związane z przeciwciałami skompleksowane z fragmentami chromatyny.

Potraktuj kompleksy kulek buforem elucyjnym o wysokiej zawartości soli, aby zakłócić interakcje białko-chromatyna i uwolnić nagie DNA bez powiązanych białek.

Użyj rozpuszczalników organicznych do ekstrakcji DNA. Dodaj bufor amplifikacyjny i uruchom reakcję łańcuchową polimerazy w celu amplifikacji fragmentów DNA. Po amplifikacji przeanalizuj sekwencję DNA.

Porównaj sekwencję amplifikowanych produktów z sekwencją genomowego DNA komórki. Znajdź region z dopasowaniem sekwencji między fragmentem a genomowym DNA - korelującym z miejscami wiązania białek.

Po zliczeniu w hemocytometrze dodaj 20 000 oczyszczonych OPC w 1 mililitrze pożywki do hodowli komórek OPC do reakcji ChIP. Następnie dodaj 27 mikrolitrów 36,5% formaldehydu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. To naprawi komórki.

Po 10 minutach dodaj 50 mikrolitrów 2,5 molowej glicyny na utrwalone komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodanie glicyny zatrzyma sieciowanie DNA-białko. Następnie przemyj usieciowane komórki 1 mililitrem buforu HBSS z koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie odwiruj komórki we wstępnie schłodzonej wirówce pod ciśnieniem 300 razy g w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po usieciowaniu oczyszczonych OPC, usieciowane ogniwa należy przemyć lodowatym roztworem HBSS, a pozostałe kroki ChIP należy przeprowadzić w temperaturze 4 stopni. W przeciwnym razie przeciwciało nie może prawidłowo wytrącić genomowego DNA.

Następnie dodaj 25 mikrolitrów pełnego buforu do lizy do osadu komórkowego i pozostaw na lodzie na 5 minut. Następnie odpipetuj 75 mikrolitrów lodowatego buforu HBSS z koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie należy ścinać chromatynę lizatu komórkowego we wstępnie schłodzonym systemie sonikacyjnym z pięcioma cyklami po 30 sekund włączenia i 30 sekund wyłączenia.

Po ścinaniu chromatyny odwirować lizat komórkowy pod ciśnieniem 14 000 razy g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pod koniec wirowania zebrać supernatant. Następnie rozcieńczyć 100 mikrolitrów ściętej chromatyny równą objętością lodowatego buforu ChIP z inhibitorem proteazy.

Następnie dodaj 1 mikrolitr przeciwciała anty-olig2 królika do 180 mikrolitrów rozcieńczonej ściętej chromatyny. Inkubować probówki na obracającym się kole przez 16 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza przy 40 obrotach na minutę. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wstępnie umytych kulek pokrytych białkiem A do probówki reakcyjnej ChIP w chłodni. Ponownie inkubuj probówki ChIP w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez kolejne 2 godziny na obracającym się kole.

Po 2 godzinach pozostaw probówkę reakcyjną ChIP na stojaku magnetycznym na minutę. Następnie umyj granulkę kulek 100 mikrolitrami czterech myjących każdy przez 4 minuty na obracającym się kole w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu elucyjnego do granulki kulki. Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 4 godziny.

Po denaturacji dwuniciowego DNA należy odfosforylować 3-główny koniec jednoniciowego DNA, dodając fosfatazę alkaliczną krewetek. Następnie dodaj ogon poli(T) do jednoniciowego DNA za pomocą końcowej deoksynukleotydylotransferazy. Następnie wyżarzaj starter DNA poly-(dA) do jednoniciowej matrycy DNA. Następnie wzmocnij bibliotekę sekwencji ChIP przy użyciu starterów do przodu i do tyłu do indeksowania.

Liczba cykli PCR w celu przygotowania biblioteki zależy od ilości wyjściowego DNA. Dobre przygotowanie biblioteki wymaga dokładnego określenia ilościowego ilości wejściowego DNA. Zbyt wiele lub zbyt mało cykli PCR może wpływać na koncentrację biblioteki, a także na złożoność, prowadząc do artefaktów PCR.

Użyj kulek paramagnetycznych, aby wybrać fragmenty w zakresie od 250 do 500 par zasad z biblioteki sekwencji ChIP amplifikowanych PCR. Użyj mikroprzepływowego urządzenia do elektroforezy kapilarnej ChIP, aby zbadać jakość wybranej biblioteki sekwencji ChIP.